臍帶血來源間充質(zhì)干細胞體外分離培養(yǎng)條件的優(yōu)化分析

韓博文

臍帶血（UCB）間充質(zhì)干細胞（MSCs）在生物學(xué)和形態(tài)學(xué)特點上與骨髓來源的MSCs存在相似性，具有多向分化的特點，為發(fā)育在中胚層的早期細胞。經(jīng)誘導(dǎo)分化和體外培養(yǎng)后，在一定條件下可向成骨細胞、神經(jīng)細胞、脂肪細胞、心肌細胞、軟骨細胞等方向分化；可在基因治療中作為載體細胞，也可在細胞治療中作為種子細胞[1]。添加血清是MSCs培養(yǎng)的傳統(tǒng)方法，但成功率較低，提高培養(yǎng)成功率對于UCB-MSCs具有非常重要的意義，是使臍帶血資源得到良好利用，明確疾病診斷的關(guān)鍵。本次就主要影響UCB-MSCs體外培養(yǎng)的相關(guān)因素進行分析，并制定干預(yù)措施，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 準備青霉素、鏈霉素、馬血清、胎牛血清、IMDM培養(yǎng)基。同時準備甲苯胺藍、β-甘油磷酸鈉、地塞米松、轉(zhuǎn)鐵蛋白等。對離心機、倒置顯微鏡、24孔培養(yǎng)板進行準備。實驗所用的臍帶血為足月產(chǎn)婦足月剖腹產(chǎn)嬰兒及足月分娩兒，每次對臍帶血進行50～100mL的采集。

1.2 方法 采集臍帶血后用密度為1.077g/mL的細胞分離液以2500r/min，20min密度梯度進行離心操作后對單個核細胞MNCs獲取。臍帶血與Ficoll分離體的體積比為1：2～1：1。用IMDM基礎(chǔ)培養(yǎng)基將分離后的細胞2次離心洗滌，對細胞密度進行調(diào)整后備用。篩選UCB-MSCs體外培養(yǎng)條件，USB-MSCs的生長過程中，細胞因子、細胞的接種密度、血清及基質(zhì)支持單獨起作用外，還相互作用，故開展相關(guān)研究。并依據(jù)結(jié)果對體外培養(yǎng)UCB-MSCs時，細胞因子添加的種類、適宜細胞因子用量進行篩選，對UCB-MSCs進行流式檢測及誘導(dǎo)分化。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行處理，計量資料進行t檢驗，計數(shù)資料進行χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

UCB-MSCs培養(yǎng)中細胞的接觸密度為最顯著的影響因素，MSCs在接種密度越大的情況下，越易生長，培養(yǎng)出MSCs的幾率越大。另外，在MSCs生長過程中添加細胞因子顯示出較為明顯的刺激生長作用，添加細胞因子GM-CSF和IL-3在高接種密度的基礎(chǔ)上，使UCB-MSCs體外原代培養(yǎng)的成功率從約30%顯著提高至90%以上（P＜0.05）。流式檢測結(jié)果顯示，細胞表達間充質(zhì)干細胞在分離培養(yǎng)中的抗原，造血細胞不表達抗原，可向脂肪、軟骨及成骨分化，一致于骨髓源的間充質(zhì)干細胞，故對培養(yǎng)方法進行確定，可將大量優(yōu)質(zhì)的UCB-MSCs種子細胞向臨床提供。

3 討論

為使UCB-MSCs原代培養(yǎng)成功率有效提高，采用正交實驗設(shè)計的方法對MSCs培養(yǎng)的主要影響因素進行考察。結(jié)果表明，在決定MSCs成功培養(yǎng)的重點因素中，除與細胞的接種密度相關(guān)外，還需適宜的細胞因子用量和種類。誘導(dǎo)分化分析和免疫表型分析證明，UCB-MSCs在傳代培養(yǎng)下仍保持干細胞特性，其表達如CD13、CD166等相關(guān)的間充質(zhì)干細胞表面標(biāo)志，而不表達CD45、CD34及HLA-DR。在表面標(biāo)志上，骨髓來源的間充質(zhì)干細胞與臍帶血來源的間充質(zhì)干細胞相一致[2]。另外，在誘導(dǎo)分化的情況下，其向軟骨、成骨、脂肪等多方向均有分化的能力被證實，誘導(dǎo)分化結(jié)果一致于骨髓來源的間充質(zhì)干細胞。對細胞的表面受體產(chǎn)生刺激，并可對化學(xué)信號進行識別和結(jié)合，靶細胞在特異的生理效應(yīng)方面起到了觸發(fā)作用。

綜上所述，采用誘導(dǎo)分化鑒定結(jié)果與流式細胞儀檢測的結(jié)果表明，將細胞因子所培養(yǎng)出的成纖維狀細胞在傳統(tǒng)培養(yǎng)方法的基礎(chǔ)上添加，為臍帶來源的間充質(zhì)干細胞，使UCB-MSCs的原代培養(yǎng)成功率顯著提高，具有非常重要的研究價值。

[1]孫艷，段芳齡，陳香宇.體外誘導(dǎo)人臍血間充質(zhì)干細胞向肝細胞樣細胞分化的研究[J].胃腸病學(xué)和肝病學(xué)雜志，2004，6（13）：239-243.

[2]Chen X,Xu H,Wan C,et al.Bioreactor expansion of human adult bone marrow-derived mesenchymal stem cells[J].Stem Cells,2006,24(9)：2052-2059.