單核苷酸多態(tài)性在法醫(yī)學領域的應用前景

孔慶波，施 念

（1.重慶警察學院，重慶401331；2.重慶市公安局刑警總隊，重慶401331）

隨著人類基因組研究的深入，遺傳標記技術相繼開發(fā)，對人類生命密碼的解讀越來越透徹。在此基礎上，相關領域的不斷融合、交叉和借鑒，致使法醫(yī)物證檢驗技術在此領域也得到了長足的發(fā)展。從20世紀90年代STR分型技術逐漸應用于法醫(yī)鑒定開始，多達9個乃至15個STR位點的復合擴增結合熒光自動測序儀的使用，使法醫(yī)物證鑒定效率大幅度提高。然而，1997年SNPs標記策略的提出［1］，在整個生物學界引起了基因多態(tài)性研究的新一輪熱潮，為法醫(yī)物證檢驗發(fā)展提供了新的前景。

1 SNPs概述

1.1 SNPs的含義

SNPs是單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphisms，SNPs）的簡稱，指基因組內特定核苷酸位置上存在著兩種不同的堿基，其中最少的一種在群體中的頻率不少于1%。SNPs主要是由基因組水平上的單個核苷酸變異所引起的DNA序列多態(tài)性。SNPs包括了人類基因組已知多態(tài)性的80%，是最常見的遺傳變異類型。與RFLP、STR相比，SNPs更廣泛地存在于基因組中，分布密度及數量均遠遠多于其他類型的DNA多態(tài)性。SNPs在單個基因或整個基因組中并不是均勻分布的。

1.2 SNPs的應用

SNPs分析在遺傳學、醫(yī)學研究上發(fā)揮著巨大的作用，其主要用途可歸納為以下三個方面［2］：

（1）醫(yī)學遺傳學方面：SNPs在同一位點上較少的多態(tài)性和在基因組中的豐富性，使之適合于自動化大規(guī)模掃描，成為第3代遺傳圖譜標記技術，標記密度可從10cm提高至1cm～2cm。在此基礎上，可進行疾病遺傳學研究。

（2）群體遺傳學方面：通過對比人群之間SNPs圖譜的異同程度，研究人類進化過程中的起源與分流［3］。

（3）藥物基因組學（pharmacogenomics）方面：通過研究與藥物活化、代謝或靶分子有關基因的SNPs，找出不同個體對藥物敏感性或耐受性的相關基因［4］，實現個性化醫(yī)療。

進行法醫(yī)學應用性研究主要是在群體遺傳學方面，包括種屬特異性、同質性、遺傳方式、突變率等。SNPs序列較短，尤其適用于高度腐敗、降解、陳舊的法醫(yī)生物檢材。

2 SNPs檢驗在法醫(yī)學領域的應用

正常男性擁有一條Y染色體，正常女性沒有Y染色體。Y染色體的性別決定功能意味著他是父系遺傳，且呈單倍型向下傳遞，不發(fā)生重組，除積累的突變外，由父親無變化的將其傳遞給兒子。Y染色體遺傳標記的這些特征，使SNPs在法醫(yī)學中具有獨特、潛在的巨大作用［5］。

2.1 SNPs檢驗應用于法醫(yī)學的方法

2.1.1 SNPs檢驗應用于法醫(yī)學的特點和優(yōu)點SNPs只涉及單個堿基的變異，因而檢驗SNPs意味著從單核苷酸水平對每個個體的DNA序列多態(tài)性進行最本質的鑒別和區(qū)分，這在法醫(yī)個人識別和親子鑒定中具有巨大的意義。同其它遺傳標記相比，SNPs具有以下適用于法醫(yī)學檢驗的特點和優(yōu)點［2］：

（1）SNPs位點含量的豐富性及分布的高密度性。雖然SNPs單位點可以提供的信息相對較少，但分布的高密度彌補了信息量的不足。

（2）SNPs的遺傳穩(wěn)定性。SNPs被認為是一種能穩(wěn)定遺傳的早期突變，較STR等多態(tài)標記具有更高的遺傳穩(wěn)定性［6］，這對于親子鑒定來說更有意義。

（3）SNPs檢驗技術自動化的可行性。SNPs標記作為雙等位基因，結果只表現為簡單的“＋／-”或“有／無”形式，這使SNPs的檢驗方法易于實現自動化或全自動化。

2.1.2 SNPs檢驗應用于法醫(yī)學的方法 以下為近年來法醫(yī)物證檢驗常用的幾種較有前景的SNPs高通量檢驗技術：

（1）DNA 芯片技術：DNA 芯片（DNA chip，又稱基因芯片，生物芯片）技術和照相平板印刷技術的有機結合以及激光共聚焦顯微技術的引入，使核酸雜交技術實現集成化，可以一次性對樣品大量序列進行實時、靈敏、準確的檢驗和分析。法醫(yī)DNA檢驗的未來有賴于DNA芯片技術的應用，快速檢驗幾百個SNPs多態(tài)性位點，并有希望制成小型化的現場包。在法醫(yī)學領域，將以DNA芯片為基礎技術，建立第三代DNA分析技術。

（2）寡核苷酸連接檢驗（oligonucleotide ligation assay，OLA）技術［6］：該方法可使法醫(yī)SNPs檢驗進一步自動化。

（3）MALDI-TOFMS（matrix-assisted laser desorption／ion-ization mass spectrometry）檢驗技術：對SNPs檢驗而言，以下兩種方法較有前景，即肽核酸（peptide nucleicacid，PNA）探針技術和引物延伸技術（primerextension）（也稱為微測序技術），可實現對SNPs的高通量檢驗［7］。

（4）Taq Man熒光探針技術［8］：Taq Man技術實現了PCR的實時定量檢驗，并且因整個反應過程一次加樣，在密封體系中進行，可將PCR污染的風險降至最低。

（5）其他新方法：近年來，進行SNPs分型的新技術層出不窮，如等溫環(huán)擴增技術（isothermal rolling circle amplification，RCA）、溫度調控高效液相色譜技術（temperature-modulated high-performance liquid chroma-tography，TmH PLC）、焦磷酸測序法（pyrosequencing）等。

2.2 SNPs檢驗在法醫(yī)學領域的應用前景

2.2.1 在個體識別中的應用 性別鑒定是法醫(yī)學中個體識別的重要內容之一。以往進行性別鑒定通常檢驗Y染色質、性激素、男女之間的差異性蛋白等來判斷。由于對檢材的要求較高，在實踐檢案中難以應用。在個體識別中的另一應用是身份鑒定，SNPs在法醫(yī)學上與選擇性STR位點有著同樣的功能，它們?yōu)樯矸蓁b別提供了基因信息。

DNA在各種生物學檢材中比較穩(wěn)定，而且檢驗技術穩(wěn)定、靈敏，已廣泛應用于法醫(yī)的實踐中。特別是以SNPs為代表的新一代遺傳標記。SNPs是人類基因組中最常見、分布最廣泛的DNA多態(tài)性類型，大約90%的人類遺傳變異是單核苷酸多態(tài)性。研究表明，SNP數比微衛(wèi)星標記數要高出幾個數量級。SNPs是二等位基因，多態(tài)信息含量不如多等位基因STR［9］，但其比STR更易通過擴增，在人群中容易通過各種不同的方法確定等位基因頻率，而且篩選只需通過有或無的分析。

目前，已經有一些SNPs鑒定試驗應用于個人識別的報道，如由歐洲法醫(yī)實驗室開發(fā)的21SNPs嵌板和 52SNPs嵌板［10］。與此同時，Kidd K K等［11］舉例說明了身份鑒定SNPs位點的選擇和嵌板的研發(fā)標準。用這種標準進行評估的結果是在40個人群中篩選出19個具有高度雜合性和低的Fst值的身份鑒定SNPs。進一步的研究已經在進行中，將會鑒定出更多符合的SNPs以滿足當前身份鑒定的需要。

2.2.2 在親權鑒定中的應用 SNPs標記數目多，覆蓋密度大，在法醫(yī)鑒定中具有巨大的潛力。SNPs多態(tài)性雖然發(fā)現才短短幾年，由于突變率低，相對穩(wěn)定，在法醫(yī)學中的親權鑒定應用價值極大。通過Y染色體的SNPs單倍型分析，當孩子是男孩，親權鑒定出現疑問或者沒有母親參與時，通過對Y染色體SNPs單倍型的分析，可進行單親的父子對親子鑒定。利用Y染色體的SNP單倍型（男性特異性）分析，還可以進行兄弟關系、叔侄關系、爺孫關系的鑒定等。

中華民族的家系以父系姓氏為主，海外僑胞、知名人士尋根問祖需鑒定是否為同一父系宗親，財產繼承需鑒定是否具有父系親緣關系等，檢驗Y染色體遺傳標記顯然有其他檢驗手段無法替代的作用。

2.2.3 在推測個體生物地理起源中的應用 個體的生物地理起源可以間接地提供一些一般的外貌信息，對調查有指導價值。法醫(yī)學STR位點雖然是很好的鑒定標記，但它們不適合用來定義個體的生物地理起源，因為人群中的等位基因是高度共享的。Y染色體和線粒體DNA單倍型因其是單親遺傳和有限的人類基因組代表性也不能作為表型的間接預測標記。而始祖多態(tài)位點（AIMs）是遍布于人類基因組的SNPs，并且在世界不同人群中的出現頻率不同。它們能夠判斷樣本的生物地理起源，從而間接地推測一些表型特點，但不能檢驗出外貌特征，因而是一種表型評價的間接方法［12］。這種方法是以人群家系結構與某些表型表達的相關性為基礎的。例如，北歐人的皮膚色素沉著比其他地區(qū)的人更淺，利用合適的數據庫可以定義不同區(qū)域人群的皮膚色素沉著程度，并將其作為始祖起源參照，則淺膚色的證據樣本可以定位在北歐地區(qū)。

這種始祖基因測試已經在2003年成功應用于美國路易斯安那州連環(huán)殺人案的調查。證物的AIMs分析結果指出，犯罪嫌疑人為非裔的可能性為85%，因而間接推測出犯罪嫌疑人為深色皮膚，為調查提供了線索。

2.2.4 在推測不同個體表型特點中的應用 AIMs可以提供關于犯罪嫌疑人外表的有用信息，它們是間接傳遞生物地理家系個體表型的唯一方式，但在描述個體外表的價值上是有限的，而且要根據具體案例情況考慮其應用的價值［12］。描述表型特點的DNA標記要能進行更加準確的外表遺傳學預測，從而識別犯罪者。在人類學研究中，它們對利用人體遺物進行面部重構具有重要價值。作為直接的方法，它需要評估顯著影響特殊表型的基因變異并開發(fā)與特殊表型相關的基因變異的數據庫。個人外表最明顯的標記是膚色、身高和面部特征，它們都是有高度遺傳性的。因此，測定SNPs是可行的，而且對預測不同表型特點有重大意義。

大量色素基因中的SNPs與各種人群頭發(fā)、皮膚和眼睛顏色的表型相關。頭發(fā)、皮膚和眼睛顏色的遺傳基礎在動物模型上已經得到很好的解釋，但目前為止關于表型SNPs的主要工作仍集中在色素沉著上。迄今為止，對于很多色素沉著復雜多基因特性的遺傳基礎已經成功闡述，為其他高遺傳性狀成因的SNPs的研究提供了希望，如身高和面部形態(tài)基因的應用將成為可能。

2.2.5 在某些案件中的獨特應用 與常染色體遺傳標記相比，對輪奸案、強奸案等案件提取的混合檢材進行鑒定時，Y染色體遺傳標記擴增分型技術更有其特殊的價值，獲得的單倍型結果不受女性成分影響。文獻［13-14］報道將男性與女性的血液混合提取DNA，對模板進行Y-SNPs位點的復合檢驗，發(fā)現男女成分比例為1 000∶1時仍能得到正確分型，不受女性成分的影響。當犯罪嫌疑人樣本無法獲得時，還可通過取其父系的任何一個男性個體的生物檢材作Y染色體遺傳標記進行排查分析，達到節(jié)約費用，縮小排查范圍的目的。

另外，Y染色體SNPs分布具有明顯的地域性，可用于進行犯罪現場遺留的生物學個體所屬群體的推斷。這將為法醫(yī)案件偵破提供新的研究思路。

3 存在的問題

通過上述的研究內容可知，SNPs用于法醫(yī)學具有可行性，而且具有其獨特的優(yōu)勢，但目前SNPs檢驗在法醫(yī)學領域實際應用中還存在諸多需要解決的問題。

（1）已有的大量研究表明，從生物檢材中檢驗有用的SNPs要比人們想象的困難得多。

（2）雖然Y-SNPs作為新一代遺傳標記，在法醫(yī)學領域有良好的應用前景，但是Y-SNPs的多態(tài)性遠遠低于Y-STR，因此建立一個適合法醫(yī)學應用的多態(tài)性高、穩(wěn)定性好的Y-SNPs復合檢驗體系需要更多的Y-SNPs位點，實驗難度大，且在實驗過程中存在檢驗步驟繁瑣、耗時長、過于敏感等，可能會得到假陽性、陰性結果。

（3）在SNPs檢驗技術方面，DNA芯片技術目前在樣品的制備、探針合成與固定、分子的標記、數據的讀取與分析等各個環(huán)節(jié)仍然存在著許多難以解決的問題，加之基因芯片技術對特殊儀器的依賴，技術成本昂貴、復雜，限制了其實際應用；MALDITOFMS技術則耗費過高，設施要求高，國內許多實驗室還無法開展；另外，高通量SNPs篩查所需技術雖然自動化程度高，但費用要比STR檢驗高，目前條件下大批量擴增和檢驗所產生的錯誤率過高，這也是阻礙其推廣使用的原因之一。

（4）世界上各種族和民族間的差異較大，每一SNPs在不同的人群可能會有不同的價值，因此，當SNPs用于法庭科學時，需調查不同種族和民族的SNPs多態(tài)性頻率。Kidd K K等［11］認為只有1／3的SNPs可用于群體遺傳學，而不像STR位點已經獲得大量的各種族和民族多態(tài)性頻率資料，能成熟地應用于法醫(yī)個體識別和親權鑒定。我國這一工作仍處于起步階段。

（5）由于目前對于Y-SNPs的檢驗尚未建立穩(wěn)定的、適合親權鑒定的復合體系，因此，國內尚未見將Y-SNPs應用于親權鑒定案例的報道，這將是法醫(yī)DNA分析的一個研究方向。

總之，SNPs應用要想在國內普及開來，以至于取代STR成為新一代的法醫(yī)物證的核心，還需在許多方面做進一步研究和大量的工作。但是，SNPs標記在法醫(yī)學樣本分析的一些特殊領域將會發(fā)揮巨大的作用。如分析高度降解的檢材、提高親緣關系和家系重建的能力用于走失人口的鑒別等，同時也能為一些案件的調查提供重要線索。身份鑒定SNPs可能會最先應用于日常工作，然后是系譜SNPs。SNPs個體生物地理起源推測和個體表型的推測將會應用在更為專業(yè)的領域，成為提供案件調查線索的一種新思路。

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