干擾素β1a基因真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建和表達(dá)

王 妍，黃志立，李艷暉，張麗君，解桂秋

（1.深圳職業(yè)技術(shù)學(xué)院應(yīng)用化學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，廣東 深圳 518055；2.吉林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院分子酶學(xué)工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 長(zhǎng)春 130012；3.吉林大學(xué)藥學(xué)院基因工程教研室，吉林 長(zhǎng)春 130021）

天然干擾素β（interferon－β，IFN－β）是糖蛋白，而重組人IFN－β分為真核表達(dá)和原核表達(dá)2種，分別稱為IFN－β1a和IFN－β1b。原核表達(dá)系統(tǒng)由于翻譯后無(wú)修飾加工的功能，所以表達(dá)的蛋白質(zhì)沒(méi)有糖基化，而哺乳動(dòng)物有高級(jí)的修飾加工功能，表達(dá)的蛋白質(zhì)與天然的蛋白質(zhì)十分接近，生物學(xué)作用和安全性也明顯增加［1］。國(guó)外上市的分別由大腸桿菌和CHO表達(dá)的2種產(chǎn)品的應(yīng)用效果顯示：用CHO真核系統(tǒng)表達(dá)的重組人IFN－β1a產(chǎn)品其蛋白與天然的蛋白（帶有糖基化）一樣，療效好且副反應(yīng)更少［2］。目前國(guó)內(nèi)外有關(guān)IFN－β的研究多集中于臨床治療上［3－5］，國(guó)內(nèi)有少量IFN－β表達(dá)方面的研究報(bào)道［6－8］，目前國(guó)內(nèi)臨床試驗(yàn)上只有用大腸桿菌表達(dá)的IFN－β，由于原核表達(dá)系統(tǒng)信號(hào)肽加工不完全、修飾功能不完善以及內(nèi)部降解等問(wèn)題，使得表達(dá)產(chǎn)物的生物比活性尚需提高，因此，采用真核表達(dá)系統(tǒng)CHO表達(dá)IFN－β具有更好的臨床療效和市場(chǎng)前景。本實(shí)驗(yàn)為了提高表達(dá)后蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，將IFN－β1a的17位半胱氨酸進(jìn)行修飾，采用化學(xué)合成法得到重組人IFN－β1a基因。將合成的IFN－β1a基因插入pSV2－dhfr質(zhì)粒中，構(gòu)建重組真核表達(dá)質(zhì)粒pSV2－dhfr－IFN－β1a，轉(zhuǎn)染CHO－dhfr－細(xì)胞，經(jīng)篩選獲得IFN－β1a活性較高的單克隆細(xì)胞株，并鑒定表達(dá)產(chǎn)物的活性，旨在為進(jìn)一步對(duì)IFN－β1a進(jìn)行純化用于制備產(chǎn)品及其生產(chǎn)工藝的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、菌株、質(zhì)粒及病毒 CHO－dhfr－細(xì)胞購(gòu)自ATCC；大腸桿菌JM109由吉林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院分子酶學(xué)工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存；質(zhì)粒pSV2－dhfr、人羊膜細(xì)胞（Wish）和水泡性口炎病毒（VSV）均由深圳職業(yè)技術(shù)學(xué)院保存。

1.2 主要試劑及儀器 限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、EcoRⅠ和M Buffer購(gòu)自TOYOBO公司；10×PCR Buffer、Taq DNA聚合酶、Pfu DNA聚合酶、DNA marker DL 2000、λDNA Hind Ⅲ marker和超純dNTPs（分別含2.5mmol·L－1dATP、dTTP、dCTP和dGTP）購(gòu)自北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司；氨芐西林（Amp）和二甲基亞砜購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；DV801A質(zhì)粒提取試劑盒、DV805ADNA純化、回收試劑盒購(gòu)自TaKaRa Biotech公司；IMDM培養(yǎng)基和RPMI1640培養(yǎng)基購(gòu)自Invitrogen公司；新生牛血清購(gòu)自杭州四季青生物工程材料有限公司；氨甲基喋呤（MTX）購(gòu)自CALBIOCHEM公司；胸苷（thymidine）購(gòu)自上海華舜生物工程有限公司；次黃嘌呤（hypoxanthine）購(gòu)自廣州展晨生物科技公司；干擾素國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自中國(guó)食品藥品質(zhì)量研究院；PolyFect Transfection Reagent轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自QIAGEN公司；Bio－Rad凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自Bio－Rad公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)及合成 根據(jù)pSV2－dhfr質(zhì)粒多克隆位點(diǎn)的序列和IFN－β1a基因序列，采用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物：上游引物P1，5′－AgT CgA TAT ggA TCC ATg AgC TAC AAC TTg CTT g－3′；下游引物P2，5′－CCT ACA Cgg AAT TCT TCA gTT TCg gAg gTA ACC Tg－3′。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.4 目的基因的合成 檢索NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)獲取IFN－β1a的cDNA全基因序列，為了提高表達(dá)后蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，本研究將IFN－β1a的17位半胱氨酸進(jìn)行修飾，并由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，得到重組人IFN－β1a基因。

1.5 IFN－β1a基因的擴(kuò)增及測(cè)序 將重組IFN－β1a基因克隆到載體pUC57，插入位點(diǎn)為SmaⅠ，受體菌為大腸桿菌DH5α菌株。培養(yǎng)含有IFN－β1a基因的大腸桿菌DH5α菌株，使用質(zhì)粒提取試劑盒提取出pUC57－IFN－β1a。用DV801A質(zhì)粒提取試劑盒抽提質(zhì)粒DNA，稀釋100倍，以其為模板，P1、P2為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3min，94℃變性1min，50℃退火1min，72℃延伸1min，36個(gè)循環(huán)，72℃延伸10min，4℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定。用BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，并送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序。

1.6 重組真核表達(dá)質(zhì)粒pSV2－dhfr－IFN－β1a的構(gòu)建和鑒定 將pSV2－dhfr質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌JM109擴(kuò)增，挑取單菌落，提取質(zhì)粒，用BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切后再純化回收，并進(jìn)行磷酸化，通過(guò)Gel Extraction Kit純化回收目的基因片段。用連接試劑盒將純化回收的目的基因IFN－β1a和磷酸化的載體pSV2－dhfr在16℃下連接1h，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌JM109，涂布500×氨芐西林平板，30℃過(guò)夜培養(yǎng)，挑取單菌落，接種于5mL 2YT培養(yǎng)液中培養(yǎng)過(guò)夜，提取質(zhì)粒，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定，并進(jìn)行PCR及雙酶切（BamHⅠ／EcoRⅠ）鑒定。鑒定正確的重組質(zhì)粒命名為pSV2－dhfr－IFN－β1a。

1.7 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及篩選 將CHO－dhfr－細(xì)胞（來(lái)自ATCC）接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，8×10個(gè)／孔，待細(xì)胞長(zhǎng)至40%～80%融合時(shí)（約需24h），用轉(zhuǎn)染試劑將經(jīng)NdeⅠ單酶切線性化的重組質(zhì)粒pSV2－dhfr－IFN－β1a轉(zhuǎn)染至CHO－dhfr－細(xì)胞中，操作按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。以空載體pSV2－dhfr轉(zhuǎn)染的細(xì)胞和未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞作為對(duì)照。轉(zhuǎn)染后第2天，吸棄培養(yǎng)基，用PBS洗滌2次后，每孔分別加入含1×10－8mol·L－1MTX的培養(yǎng)基培養(yǎng)；3周后，將MTX濃度提高至3×10－7mol·L－1繼續(xù)加壓篩選，并對(duì)MTX濃度與IFN活力關(guān)系進(jìn)行優(yōu)化。

1.8 IFN－β1a抗病毒活性的檢測(cè) 按照《中國(guó)藥典》三部（2010版）方法，采用Wish細(xì)胞病變抑制法，以IFN－β國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品作為對(duì)照品，參考文獻(xiàn)［9］進(jìn)行。用自動(dòng)酶標(biāo)儀測(cè)定樣品的效價(jià)值，參比波長(zhǎng)為630nm，檢測(cè)波長(zhǎng)為570nm。以保護(hù)半數(shù)細(xì)胞免受病毒損害的最高干擾素稀釋度為1個(gè)IFN活性單位。

1.9 轉(zhuǎn)染細(xì)胞的鑒定 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的轉(zhuǎn)染細(xì)胞，采用酚／氯仿法提取其基因組DNA，按照1.4項(xiàng)中的反應(yīng)條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增，確定IFN－β1a基因是否克隆進(jìn)CHO－dhfr－細(xì)胞。

2 結(jié) 果

2.1 IFN－β1a基因擴(kuò)增產(chǎn)物的序列測(cè)定 IFN－β1a基因擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳分析，特異片段大小與預(yù)期相符。見(jiàn)圖1。基因測(cè)序結(jié)果表明：人IFN－β基因序列正確以及插入序列正確。

2.2 重組真核表達(dá)質(zhì)粒的鑒定 按照質(zhì)粒提取的方法將5個(gè)單菌落進(jìn)行提取質(zhì)粒，對(duì)提取的質(zhì)粒進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳鑒定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：5個(gè)單菌落提取的質(zhì)粒經(jīng)IFN－β的引物PCR擴(kuò)增均可見(jiàn)目標(biāo)電泳帶，大小與預(yù)期相符。見(jiàn)圖2。質(zhì)粒pSV2－dhfr－IFN－β1a的雙酶切及PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳分析，均可見(jiàn)目的基因條帶，大小與預(yù)期相符。見(jiàn)圖3。表明重組真核表達(dá)質(zhì)粒pSV2－dhfr－IFN－β1a構(gòu)建正確。

2.3 轉(zhuǎn)染細(xì)胞的鑒定 瓊脂糖凝膠電泳分析顯示：以轉(zhuǎn)染細(xì)胞基因組DNA為模板，可擴(kuò)增出約500bp的特異條帶，表明IFN－β1a基因已成功克隆入CHO－dhfr－細(xì)胞。見(jiàn)圖4。

圖1 IFN－β1a基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Electrophoregram of PCR product of IFN－β1agene

圖2 從質(zhì)粒pSV2－dhfr－IFN－β1a擴(kuò)增目的基因的電泳圖Fig.2 Electrophoregram of amplification of target gene from plasmid pSV2－dhfr－IFN－β1a

圖3 重組真核表達(dá)質(zhì)粒pSV2－dhfr－IFN－β1a的PCR及酶切鑒定Fig.3 Identification of recombinant plasmid of pSV2－dhfr－IFN－β1aby PCR and restriction enzyme digestion

圖4 轉(zhuǎn)染細(xì)胞的PCR鑒定Fig.4 Identification of transfected cells by PCR

2.4 MTX有效濃度的確定 由于CHO－dhfr－細(xì)胞的生長(zhǎng)需要添加胸苷和次黃嘌呤，因此完全培養(yǎng)基中都加入了這2種營(yíng)養(yǎng)，當(dāng)將培養(yǎng)基換成普通培養(yǎng)基時(shí)細(xì)胞也能繼續(xù)分裂數(shù)次，但在隨后的持續(xù)培養(yǎng)過(guò)程中，活細(xì)胞并不死亡，只是在慢慢衰老，但當(dāng)培養(yǎng)基中加入1×10－7mol·L－1的MTX后該缺陷型細(xì)胞全部死亡，因此在初篩過(guò)程中選擇的MTX濃度為1×10－7mol·L－1。見(jiàn)表1。

2.5 MTX濃度的優(yōu)化 將轉(zhuǎn)化細(xì)胞培養(yǎng)至60%～80%密度后加入不同濃度的MTX進(jìn)行初步優(yōu)化，MTX濃度為5×10－8、1×10－7、2×10－7、4×10－7、1×10－6和2×10－6mol·L－1。IFN表達(dá)水平見(jiàn)圖5。

表1 CHO－dhfr－細(xì)胞對(duì)MTX的耐受程度測(cè)定Tab.1 Tolerance test of CHO－dhfr－cells against MTX

根據(jù)活性測(cè)定值以及顯微鏡檢查細(xì)胞生長(zhǎng)狀況，初步確定MTX濃度為5×10－8～4×10－7mol·L－1（圖5A），再次選擇5×10－8、1×10－7、1.5×10－7、2×10－7、2.5×10－7和3×10－7mol·L－1。最終確定最佳MTX濃度為（1～2）×10－7mol·L－1（圖5B），轉(zhuǎn)瓶表達(dá)時(shí)使用1.5×10－7mol·L－1濃度的MTX取得了最好的表達(dá)效果。

圖5 MTX濃度篩選圖Fig.5 Screening of MTX concentration

3 討 論

目前IFN－β1a已經(jīng)廣泛用于病毒性感染、惡性腫瘤以及自身免疫性疾病的治療或?qū)嶒?yàn)性治療。1993年FDA批準(zhǔn)了先靈公司制造的IFN－β1b（E.coli表達(dá)）上市銷(xiāo)售，用于治療多發(fā)性硬化癥和神經(jīng)系統(tǒng)疾病，后來(lái)先靈公司又開(kāi)發(fā)了由CHO細(xì)胞表達(dá)的IFN－β1a。用CHO真核系統(tǒng)表達(dá)的重組人IFN－β1a產(chǎn)品其蛋白與天然的蛋白（帶有糖基化）一樣，療效好且副反應(yīng)更少，具有糖基化，更接近天然的蛋白，療效更好，尤其副反應(yīng)低［10］。

哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)所表達(dá)的重組蛋白與天然蛋白在結(jié)構(gòu)和功能上均高度一致，該系統(tǒng)是能夠通過(guò)臨床要求的具有蛋白質(zhì)修飾作用的外源蛋白表達(dá)系統(tǒng)。目前可用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的篩選標(biāo)記有多種，雖然許多細(xì)胞系可用于擴(kuò)增基因，但最常用的還是CHO細(xì)胞［11］。常用的CHO細(xì)胞包括CHO－K1和CHO－dhfr－，K1為原始細(xì)胞系，dhfr－為二氫葉酸缺陷型。目前最常用的也是最成功的系統(tǒng)為氨甲基喋呤用于二氫葉酸還原酶基因的擴(kuò)增，本研究通過(guò)二氫葉酸還原酶缺陷型的CHO細(xì)胞，在氨甲基喋呤篩選擴(kuò)增下，使外源蛋白得到高效表達(dá)。

IFN－β1a為由166個(gè)氨基酸組成的糖基化蛋白，相對(duì)分子質(zhì)量為23000，肽鏈中含3個(gè)半胱氨酸，分別在17、31和141位，第31和141位的半胱氨酸之間形成的二硫鍵對(duì)IFN－β的生物學(xué)活性非常重要。第141位的Cys被Tyr替代后則完全喪失抗病毒作用，第17位的Cys對(duì)保持IFN－β的空間結(jié)構(gòu)無(wú)明顯的作用，該Cys被Ser替代后不但對(duì)其生物學(xué)活性無(wú)影響，反而使其分子更加穩(wěn)定，同時(shí)也減少其與第141位Cys形成二硫鍵的幾率。本研究采用Ser替代17位的Cys，使表達(dá)的產(chǎn)物在穩(wěn)定性方面占有優(yōu)勢(shì)［12］。

一般情況下用動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)體系來(lái)表達(dá)外源基因，其表達(dá)水平通常比采用大腸桿菌表達(dá)體系低，速度慢，因此，表達(dá)策略的選擇就顯得十分重要。本研究選擇CHO－dhfr－作為表達(dá)系統(tǒng)，質(zhì)粒pSV2－dhfr作為表達(dá)載體表達(dá)IFN－β1a基因。為了保證dhfr基因和Amp基因的完整，結(jié)合pSV2－dhfr－IFN－β1a質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)，根據(jù)pSV2－dhfr的基因圖譜和IFN－β1a的基因序列，選擇BamHⅠ和EcoRⅠ作為基因插入位點(diǎn)。

外源基因在不同表達(dá)體系中的表達(dá)水平差異很大［13］，而在細(xì)菌、酵母和動(dòng)物細(xì)胞中又有糖基化水平不同的問(wèn)題，導(dǎo)致相對(duì)分子質(zhì)量也不同。本研究經(jīng)NdeⅠ單酶切線性化重組質(zhì)粒pSV2－dhfr－IFN－β1a，采用不同于美國(guó)專(zhuān)利的連接方法［14］，改變了原來(lái)用篩選的方法最后確定載體和構(gòu)建的實(shí)驗(yàn)方案。另一技術(shù)關(guān)鍵點(diǎn)是線性化處理的酶不同，這對(duì)于構(gòu)建很重要，可通過(guò)轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞克隆看出明顯的區(qū)別。本研究篩選到5個(gè)單克隆細(xì)胞株，其中2個(gè)細(xì)胞株的IFN－β1a表達(dá)后純化產(chǎn)物的活性與國(guó)外上市產(chǎn)品及美國(guó)FDA產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)相近。因基因整合隨機(jī)性較大（CHO細(xì)胞染色體上約有1500個(gè)位點(diǎn)可整合基因），對(duì)目的基因的表達(dá)影響較大（10多個(gè)可高效表達(dá)的位點(diǎn)），為了獲得高水平表達(dá)株，至少需要篩選幾百個(gè)有活性的克隆株；而線性化情況和整合位點(diǎn)的不同影響基因的表達(dá)水平，因此在在整個(gè)篩選過(guò)程中均需使用MTX維持，將未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞株淘汰。而適當(dāng)?shù)腗TX濃度壓力將使IFN的表達(dá)始終維持在較高水平，并對(duì)細(xì)胞無(wú)明顯負(fù)面作用。在一定范圍內(nèi)，細(xì)胞表達(dá)IFN的量和加入的MTX濃度密切相關(guān)，在＜1.5×10－7mol·L－1的濃度下，IFN的表達(dá)量和MTX的濃度幾乎成線性關(guān)系，這是由于dhfr基因和IFN基因是串連關(guān)系，在抗生素的壓力下，dhfr基因大量表達(dá)，由于基因的順式表達(dá)，導(dǎo)致IFN基因也大量表達(dá)，因此此時(shí)MTX的濃度對(duì)IFN表達(dá)的影響是正面的。但當(dāng)MTX濃度太高，超過(guò)細(xì)胞的承受極限時(shí)MTX就抑制了細(xì)胞的新陳代謝，阻止了細(xì)胞的分裂，甚至加速細(xì)胞死亡。因此高濃度MTX作用下IFN表達(dá)水平持續(xù)下降。通過(guò)MTX增壓，IFN的表達(dá)水平從1.9×104IU·L－1提高到1.3×105IU·L－1。經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)優(yōu)化后IFN表達(dá)水平達(dá)到3×105IU·L－1。本實(shí)驗(yàn)所獲得細(xì)胞表達(dá)的IFN－β1a的生物活性比本文作者先前采用CHO細(xì)胞表達(dá)的IFN－α2b［15］高10倍，是國(guó)內(nèi)相關(guān)研究［8］的2倍多。

綜上所述，本研究成功構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pSV2－dhfr－IFN－β1a，并在CHO細(xì)胞中表達(dá)IFN－β1α蛋白，且表達(dá)的蛋白生物活性較高，為下一步采用真核表達(dá)系統(tǒng)在我國(guó)進(jìn)行產(chǎn)業(yè)化開(kāi)發(fā)該蛋白奠定基礎(chǔ)。

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