三種酚酸對(duì)α－淀粉酶的抑制作用

宋 媛 周池虹伶 歐仕益

（1．暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院校門(mén)診部，廣東 廣州 510632；2．暨南大學(xué)食品科學(xué)與工程系，廣東 廣州 510632）

糖尿?。╠iabetes mellitus，DM）已逐漸成為繼心血管病、腫瘤之后嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康的第三大疾?。?］。在糖尿病人中，超過(guò)90%的病人屬于Ⅱ型糖尿病（非胰島素依賴(lài)型糖尿?。@類(lèi)病人不需要胰島素的治療，僅用飲食調(diào)節(jié)即可有效控制血糖［2］。在飲食調(diào)節(jié)無(wú)效的情況下就需增加藥物治療，其中α－葡萄糖苷酶抑制劑具有較好的療效，被認(rèn)為是Ⅱ型糖尿病的首選藥和Ⅰ型糖尿病的胰島素治療的輔助藥物［3］。其作用機(jī)制：可競(jìng)爭(zhēng)性地抑制寡糖的分解，延緩了雙糖、低聚糖及多糖分解為葡萄糖，從而降低餐后血糖［4］。

目前，醫(yī)學(xué)界公認(rèn)療效較好的α－葡萄糖苷酶抑制劑就是通過(guò)抑制α－淀粉酶的活性來(lái)達(dá)到治療目的，α－淀粉酶抑制劑是屬于糖苷水解酶抑制劑中的一種，它因能阻礙食物中碳水化合物的水解和消化，減少糖分的攝取，降低血糖和血脂含量水平值而被廣泛研究［5］。α－淀粉酶和α－葡萄糖苷酶抑制劑的制備大多采用微生物發(fā)酵法，原料來(lái)源少，生產(chǎn)成本高，因此，有必要從天然藥物原料中尋找安全高效的α－淀粉酶抑制劑來(lái)防治糖尿病。

酚酸類(lèi)化合物是一類(lèi)含有酚羥基和羧基的一類(lèi)物質(zhì)，研究［6－8］表明，酚類(lèi)物質(zhì)能與蛋白相互作用從而影響酶的活性。綠原酸是由咖啡酸和奎尼酸組成的一類(lèi)縮合酚酸，是金銀花、杜仲等中藥材的活性成分，具有抗氧化、保護(hù)心血管、抗誘變、抗癌、抗菌、抗病毒、降脂降糖和免疫調(diào)節(jié)等作用［9］。阿魏酸的化學(xué)名稱(chēng)為4－羥基－3－甲氧基肉桂酸，是當(dāng)歸、川芎等中藥材的活性成分，具有抗氧化、抗血栓、降脂、抗菌消炎、抗突變和預(yù)防癌腫等作用［10］。對(duì)－香豆酸的化學(xué)名稱(chēng)為4－羥基肉桂酸，是杜仲葉的有效成分之一，具有抗氧化、抗菌和抗突變、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、利膽、調(diào)節(jié)免疫、提高精子活力、抑制黑色素形成、預(yù)防由亞硝酸鹽引起的結(jié)腸炎等作用，能有效降低心血管疾病的發(fā)病率［11，12］。阿魏酸和綠原酸已被衛(wèi)生部批準(zhǔn)為保健食品原料［13］，是一類(lèi)安全、無(wú)害的物質(zhì)。關(guān)于3種酚酸協(xié)同對(duì)α－淀粉酶活性的影響目前未見(jiàn)報(bào)道。因此本研究擬選用阿魏酸、綠原酸、對(duì)－香豆酸3種酚酸協(xié)同研究其對(duì)α－淀粉酶的抑制作用，以期開(kāi)發(fā)一類(lèi)新型α－淀粉酶抑制劑用作糖尿病人的功能性食品。

1 材料與方法

1．1 材料與試劑

可溶性淀粉、苯酚、葡萄糖：AR 級(jí)，天津市大茂化學(xué)試劑廠；

α－淀粉酶：2 000U／g，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；

阿魏酸、對(duì)－香豆酸：98%，廣州市齊云生物技術(shù)有限公司；

綠原酸：97%，遠(yuǎn)航生物技術(shù)有限公司；

磷酸氫二鈉：AR 級(jí)，天津市化學(xué)試劑廠；

吐溫20：CP級(jí)，天津市福晨化學(xué)試劑廠；

磷酸二氫鉀、氫氧化鈉、酒石酸鉀鈉、無(wú)水亞硫酸鈉：AR級(jí)，天津市福晨化學(xué)試劑廠；

3，5－二硝基水楊酸（DNS）：AR 級(jí)，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1．2 儀器與設(shè)備

水浴恒溫振蕩器：SHA－B型，江蘇金壇市醫(yī)療儀器廠；

低速離心機(jī)：KDC－1044型，科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司；

紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：UV－9600型，北京瑞利分析儀器公司；

精密電子天平：HR－200型，廣州市艾安德儀器有限公司；

電子天平：MP5002B型，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；

電磁爐：KY－PC113A－L型，松下電器（中國(guó)）有限公司。

1．3 方法

1．3．1 酚酸對(duì)α－淀粉酶活力的影響 用0．05 mol／L 磷酸鹽緩沖液（pH＝6．5）分別配制質(zhì)量濃度為2 U／mL 的α－淀粉酶液和40 mg／mL 的可溶性淀粉溶液，以及質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0．1%，0．2%，0．4%的阿魏酸、綠原酸、對(duì)－香豆酸溶液（配制時(shí)，加入體積分?jǐn)?shù)2%的吐溫20使酚酸完全溶解）。

取100mL三角瓶，各加入10mL酶液和25mL酚酸溶液，在37 ℃的恒溫振蕩器振蕩（100r／min）保溫5min后，加入25mL的可溶性淀粉溶液，再將其在37 ℃的恒溫振蕩器振蕩（100r／min）反應(yīng)30 min，取1 mL 樣液于離心管中，加入1mol／L 的氫氧化鈉1 mL 終止酶促反應(yīng)，稀釋5 倍，離心，取1mL上清液，用3，5－二硝基水楊酸法（DNS法）測(cè)定還原糖，各處理重復(fù)3次。

1．3．2 酚酸混合物對(duì)α－淀粉酶活力的影響 在1．3．1研究結(jié)果的基礎(chǔ)上，選擇不同濃度的3 種酚酸復(fù)配，觀察其對(duì)α－淀粉酶的抑制作用。

1．3．3 淀粉酶抑制率的計(jì)算

2 結(jié)果與分析

2．1 3種酚酸單獨(dú)存在時(shí)對(duì)α－淀粉酶活力的影響

不同濃度的3種酚酸對(duì)α－淀粉酶活力的影響見(jiàn)表1。由表1可知，酚酸種類(lèi)和濃度對(duì)α－淀粉酶活力的影響很大。阿魏酸添加量為0．02%時(shí)對(duì)α－淀粉酶有微弱的促進(jìn)作用，隨著添加濃度的增加，抑制作用增加；濃度再進(jìn)一步增加時(shí)抑制效果反而下降。綠原酸在添加量為0．05%時(shí)抑制作用達(dá)到最高，而后隨著添加量的增加抑制效果下降；香豆酸的影響趨勢(shì)與綠原酸近似，但添加量大于0．2%時(shí)反而提高α－淀粉酶活力。

表1 不同質(zhì)量濃度的酚酸對(duì)α－淀粉酶的抑制百分率Table1 Effect of different concentrations of phenolic acids on the inhibition ofα－amylase（n ＝3） ／%

阿魏酸和香豆酸是纖維質(zhì)中含有的酚酸，研究阿魏酸和香豆酸對(duì)纖維素酶和木聚糖酶的影響有些報(bào)道。研究［14，15］發(fā)現(xiàn)，高濃度的酚酸（10～50mM）會(huì)抑制纖維素酶和木聚糖酶活性，而低濃度的酚酸則提高這兩種酶的活性［16］。本課題組［17］曾采用紫外、熒光和圓二色譜研究發(fā)現(xiàn)，酚酸的加入會(huì)影響纖維素酶的空間結(jié)構(gòu)，降低α螺旋含量，增加β折疊和無(wú)規(guī)線(xiàn)團(tuán)含量。因此，適當(dāng)濃度的酚酸可增加纖維素酶的柔性，提高酶的活力。同時(shí)，酚酸可和酶活性中心所含芳香族氨基酸反應(yīng)，從而降低酶的活性，因此酚酸究竟是促進(jìn)還是抑制纖維素酶活性，關(guān)鍵取決于其添加濃度。

由于α－淀粉酶能催化淀粉α－1，4糖苷鍵水解，而酚酸對(duì)α－淀粉酶的作用機(jī)制可能與其對(duì)纖維素酶和木聚糖酶的作用機(jī)制類(lèi)似。本研究發(fā)現(xiàn)，濃度為0．05%的阿魏酸、綠原酸以及對(duì)－香豆酸對(duì)α－淀粉酶的抑制百分率較高。這也提示在此濃度下這3 種酚酸對(duì)α－淀粉酶抑制作用較大，在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探究3 種酚酸同時(shí)添加時(shí)對(duì)α－淀粉酶的抑制作用。

2．2 3種酚酸復(fù)配對(duì)α－淀粉酶活力的影響

由表1結(jié)果可知，酚酸濃度對(duì)α－淀粉酶活力影響很大。故將酚酸總濃度控制在0．2%以下進(jìn)行復(fù)配添加，研究了其對(duì)α－淀粉酶活力的影響，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 不同濃度酚酸復(fù)配后對(duì)α－淀粉酶的抑制作用Table2 Effect of mixture of phenolic acids on the inhibition ofα－amylase（n ＝3） ／%

由表2可知，在合適的濃度下，3種酚酸對(duì)α－淀粉酶的抑制表現(xiàn)出協(xié)同作用，抑制率為12．62%～98．77%；當(dāng)阿魏酸、綠原酸和對(duì)－香豆酸的質(zhì)量濃度分別為0．07%，0．05%和0．04%時(shí)，α－淀粉酶活力幾乎完全被抑制，抑制率達(dá)到98．77%。

3 結(jié)論

酚酸混合液具有較好的協(xié)同抑制作用。與纖維素酶和木聚糖酶的活性中心氨基酸組成不同，淀粉酶活性中心沒(méi)有芳香族氨基酸，因此酚酸對(duì)α－淀粉酶的的協(xié)同作用機(jī)理還有待進(jìn)一步探討。

酚酸類(lèi)化合物是一類(lèi)含有酚羥基和羧基的一類(lèi)物質(zhì)，酚類(lèi)物質(zhì)能與蛋白相互作用從而影響酶的活性。通過(guò)體外試驗(yàn)研究，表明阿魏酸、綠原酸、對(duì)－香豆酸這3 種酚酸的混合液在一定濃度范圍內(nèi)能夠抑制α－淀粉酶的活力。3 種酚酸在質(zhì)量濃度為0．05%時(shí)，具有較好的抑制效果；當(dāng)阿魏酸、綠原酸和對(duì)－香豆酸分別按0．07%，0．05%和0．04%的質(zhì)量濃度混合添加時(shí)，對(duì)α－淀粉酶抑制率達(dá)到98．77%，表明這3種

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