實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測REST基因在小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)及其臨床意義

葛付超,武慶杰,武星汝

(菏澤醫(yī)學(xué)?？茖W(xué)校，山東菏澤274000)

實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測REST基因在小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)及其臨床意義

葛付超,武慶杰,武星汝

(菏澤醫(yī)學(xué)專科學(xué)校，山東菏澤274000)

目的探討REST基因在小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)及其臨床意義。方法應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對30例小細(xì)胞肺癌組織及癌旁組織中REST進(jìn)行檢測。結(jié)果REST在小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)水平0.596比正常肺組織0.949明顯降低(P＜0.05)，小細(xì)胞肺癌組織中REST的表達(dá)與腫瘤的分化程度及侵襲性有關(guān)（P＜0.05）。結(jié)論REST在小細(xì)胞肺癌組織中有低表達(dá)，可能參與小細(xì)胞肺癌的發(fā)病，可能有助于小細(xì)胞肺癌的早期診斷、治療及預(yù)后。

神經(jīng)元限制性沉默轉(zhuǎn)錄因子；小細(xì)胞肺癌；實(shí)時(shí)定量RT-PCR

肺癌是呼吸系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，在世界上許多國家和地區(qū)，肺癌的發(fā)病率占惡性腫瘤的首位。小細(xì)胞肺癌約占肺癌的20%，惡性程度高，倍增時(shí)間短，轉(zhuǎn)移早而廣泛。Sutherland等研究發(fā)現(xiàn)成鼠肺癌細(xì)胞中的Trp53和Rb1失活，可使神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)樾〖?xì)胞肺癌因此認(rèn)為神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞是小細(xì)胞肺癌的主要起源細(xì)胞[1]。小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中可見密集神經(jīng)分泌顆粒，內(nèi)含神經(jīng)內(nèi)分泌激素，使得小細(xì)胞肺癌與內(nèi)分泌和副腫瘤綜合征相關(guān)。神經(jīng)元限制性沉默轉(zhuǎn)錄因子（RE1-silencing transcription factor，REST)不僅在神經(jīng)元的發(fā)生和分化過程中起重要的調(diào)控作用[2]，而且可能還參與了細(xì)胞凋亡、基因復(fù)制、轉(zhuǎn)綠調(diào)控、血管形成、腫瘤形成等[3-4]。本文應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對30例小細(xì)胞肺癌組織及正常癌旁組織中REST基因進(jìn)行檢測，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1臨床資料

1.1一般資料新鮮小細(xì)胞肺癌組織和距癌組織30例邊緣3 cm以上的正常肺組織，取自2010年1月—12月青海大學(xué)附屬醫(yī)院胸外科患者，標(biāo)本均經(jīng)病理證實(shí)。

1.2主要試劑及儀器TRIzoL試劑、RT-PCR反應(yīng)試劑盒(美國BD公司)，M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒(Promega公司產(chǎn)品)，紫外分光光度計(jì)(美國Thermo公司)，7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國ABI公司)。

1.3 REST基因相對表達(dá)量的檢測

1.3.1引物和探針的設(shè)計(jì)與合成所有引物通過primer premier5.0軟件設(shè)計(jì)，由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。REST：上游引物：5'-AGTGAAAGGGCACGGAAGG-3'；下游引物：5'-TGGCAGTGGTGGTGATGG-3'。擴(kuò)增片段長度123bp。GAPDH：上游引物：5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3'；下游引物：5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3'。擴(kuò)增片段長度225bp。對不同引物序列進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，以保證目的基因與內(nèi)參基因擴(kuò)增效率一致且均接近1。

1.3.2總RNA提取及cDNA合成取凍存組織約100mg，采用TRIzoL提取總RNA，紫外分光光度計(jì)測定吸光度A260/A280比值，明確RNA純度及濃度，并經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳證實(shí)RNA完整。取總RNA2μg經(jīng)M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒合成cDNA第一鏈。反應(yīng)條件：37℃、65min，72℃、10min。

1.3.3實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR每一樣品均設(shè)2個(gè)重復(fù)孔，反應(yīng)體系均為10μL，反應(yīng)條件：94℃變性20 s、95℃5 s、60℃40 s，40個(gè)循環(huán)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀監(jiān)測記錄數(shù)據(jù)。每次PCR反應(yīng)后均進(jìn)行熔解曲線分析以確認(rèn)擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。

1.3.4 REST家族基因mRNA表達(dá)水平相對定量分析采用2-△△Ct法[5]，計(jì)算REST基因表達(dá)量，即以GAPDH為內(nèi)參照基因，計(jì)算各樣品△Ct(RESTCt-GAPDHCt)，設(shè)定△Ct值最大的正常對照為校正樣品，計(jì)算△△Ct(各樣品△Ct-校正品△Ct)，某樣品的REST基因mRNA相對表達(dá)量(RQ)可用如下公式計(jì)算：RQ=2-△△Ct。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料采用±s表示，REST基因表達(dá)水平差異分析采用配對t檢驗(yàn)。REST基因與臨床病理特征的關(guān)系分析采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1 REST基因在小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)小細(xì)胞肺癌組織中REST基因mRNA水平(0.596±0.143)低于癌旁組織(0.949±0.270)，兩者差異具有顯著性(P＜0.05),見圖1。

2.2 REST基因與臨床病理特征的關(guān)系小細(xì)胞肺癌中RESTmRNA的表達(dá)與癌細(xì)胞分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床TNM分期有關(guān)，而與性別、年齡無關(guān)。高/中分化小細(xì)胞肺癌高于低分化小細(xì)胞肺癌者（0.814±0.266/0.608±0.179）,P＜0.05；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的小細(xì)胞肺癌REST-mRNA表達(dá)水平低于無轉(zhuǎn)移者（0.564±0.236/0.828±0.207）,P＜0.05；TNM分期Ⅰ+Ⅱ的小細(xì)胞肺癌表達(dá)水平明顯高于Ⅲ+Ⅳ小細(xì)胞肺癌（0.842±0.192/0.568±0.264），P＜0.05。而男、女（0.675±0.232/0.698±0.187）及大于60歲、60歲以下(0.721±0.265/0.671±0.178)REST-mRNA表達(dá)均無明顯差異（P＞0.05）。

3討論

小細(xì)胞肺癌作為一種侵襲性疾病，疾病進(jìn)展較快，易發(fā)生較早轉(zhuǎn)移，在過去的30年中，小細(xì)胞肺癌的研究及治療幾乎沒有進(jìn)展，其發(fā)生發(fā)展是多基因參與的多步驟、多階段、多環(huán)節(jié)、多因素，涉及到細(xì)胞內(nèi)眾多分子事件的復(fù)雜過程。抑癌基因的缺失和（或）突變及轉(zhuǎn)錄調(diào)控體系的異常是導(dǎo)致小細(xì)胞肺癌發(fā)生的主要原因。目前研究表明與小細(xì)胞肺癌發(fā)生、發(fā)展、治療及預(yù)后密切相關(guān)的基因包括癌基因p53、RB基因，癌基因Bcl-2、Myc基因及PI3K/AKT/ mTOR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[6]。故對小細(xì)胞肺癌發(fā)生發(fā)展中相關(guān)基因異常的認(rèn)識(shí)是小細(xì)胞肺癌防治的關(guān)鍵。小細(xì)胞肺癌具有異質(zhì)性，其細(xì)胞起源目前尚未明確，研究發(fā)現(xiàn)，小細(xì)胞肺癌起源于支氣管黏膜或腺上皮內(nèi)的Kulchitsky細(xì)胞（嗜銀細(xì)胞），屬APUD（amine precursor uptake decarboxylation）瘤[7]。但Park等[8]通過建立鼠小細(xì)胞肺癌模型研究發(fā)現(xiàn)，小細(xì)胞肺癌可能起源于支氣管黏膜上皮中可向神經(jīng)內(nèi)分泌分化的干細(xì)胞。

REST于1995年首次由Mandel實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)。REST蛋白含九個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)，作為一個(gè)抑制轉(zhuǎn)錄因子，REST氨基端的八個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)構(gòu)成REST的DNA結(jié)構(gòu)域，可以與目標(biāo)基因調(diào)節(jié)區(qū)域中的抑制元件位點(diǎn)結(jié)合而調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄。REST通常在非神經(jīng)元細(xì)胞核未成熟的神經(jīng)細(xì)胞中表達(dá)，它是抑制細(xì)胞中神經(jīng)元相關(guān)基因表達(dá)的關(guān)鍵因子，其作用是阻止細(xì)胞向神經(jīng)元方向分化[9]。而當(dāng)神經(jīng)前體細(xì)胞開始向神經(jīng)細(xì)胞分化時(shí)，REST蛋白的表達(dá)開始逐漸下降，當(dāng)細(xì)胞完全分化為成熟的神經(jīng)元細(xì)胞后，REST幾乎無表達(dá)[10]?；赗EST在抑制細(xì)胞向神經(jīng)元方向分化、抑制神經(jīng)內(nèi)分泌相關(guān)基因表達(dá)方面的重要作用，可以推斷在腫瘤細(xì)胞內(nèi)REST功能缺失可能是引起腫瘤出現(xiàn)神經(jīng)內(nèi)分泌分化的原因之一，從而進(jìn)一步影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在小細(xì)胞肺癌組織中，REST的表達(dá)明顯低于癌旁組織，考慮REST可能通過喪失對干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞方面分化的抑制作用而參與小細(xì)胞肺癌的發(fā)生和發(fā)展。提示針對REST的靶向治療，可能為小細(xì)胞肺癌的治療提供新的治療方向。本研究還顯示，REST基因的表達(dá)與癌細(xì)胞分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床TNM分期有關(guān)，提示REST基因的檢測可能在小細(xì)胞肺癌的臨床分期和預(yù)后中有一定的臨床意義。

[1]Sutherland KD,Proost N,Brouns L,et al.Cell of origin of small cell lung cancer：inactivation of Trp53 and Rb1 in distinct cell types of adultmouse lung[J].Cancer cell,2011,19(6)：754-764.

[2]Ooi L,Wood IC.Chromatin crosstalk in developmentand disease：lessons from REST[J].NatRev Genet,2007,8(7)：544-54.

[3]Ariano P,Zamburlin P,D，Alessandro R,etal.Differential repression by the transcription factor REST/NRSF of the various Ca2+signalling mechanisms in pheochromocytoma PC12 cells[J].Cell Calcium, 2010,47(4)：60-368.

[4]Blom T,Tynninen O,PuputtiM,et al.Molecular genetic analysis of the REST/NRSF gene in nervous system tumors[J].Acta Neuropathol, 2006,112(4)：483-490.

[5]庾蕾，劉建平，莊志雄,等.實(shí)時(shí)RT-PCR基因表達(dá)相對定量REST軟件分析與2-△△Ct法比較[J].熱帶醫(yī)學(xué)雜志，2007,7（10）：956-958.

[6]Tsurutani J,West KA,Sayyah J,et al.Inhibition of the phosphatidylinositol 3-kinase/Akt/mammalian target of rapamycin pathway but not the MEK/ERK pathway attenuates laminin-mediated?small cell lung cancer?cellular survival and resistance to imatinibmesylate or chemotherapy[J].Cancer Res.2005,65(18)：8423-32.

[7]程穎,柳菁菁.小細(xì)胞肺癌轉(zhuǎn)化研究的探索[J].中國新藥研究，2012, 21（17）：24-28.

[8]Park KS,Ling MC,Raiser DM,etal.Characterization of the cell of origin for smallcell lung cancer[J].cellcycle,2011,10(16)：2806-2818.

[9]呂輝，文繼舫，吳曉英.REST在乳腺癌中的功能研究[C].中華醫(yī)學(xué)會(huì)病理學(xué)分會(huì)2010年學(xué)術(shù)年會(huì)，2010：128-132.

[10]Abrajano JJ,Qureshi IA,Gokhan S,etal.REST and CoRESTmodulate neuronal subtype specification,maturation and maintenance[J]. PlosOne,2009,4(12)：e7936.

Detection and Clinical Significance of REST in Sm all Cell Lung Cancer by Real-tim e Quantitative PCR

Ge Fuchao,W u Qingjie,W u X ingru
（Heze MedicalCollege,Heze 274000,Shandong）

Ob jectiveTo explore the clinicalsignificance of REST expression in small cell lung cancer.M ethodsThe real-time quantitative RT-PCR wasused to detect the expression of RESTmRNA in 30 patientsw ith small cell lung cancer and their normal transitional cell tissues.Resu ltsThe expression of RESTmRNA in the small cell lung cancer tissues(0.596)was significantly down-regulated than that in the normal transitional cell tissues(0.949).The expression RESTmRNA in well-moderated differentiation small cell lung cancerwere higher than those in poor differentiation small cell lung cancer(P＜0.05).ConclusionThere isaberrantexpression of REST in small cell lung cancer.They are involved in the pathogenesisof small cell lung can cer.To detect theexpression of RESTmRNA may be a reliablemeans for early diagnosis,treatmentand prognosisof small cell lung cancer.

RE-silencing transcription factor;Small cell lung cancer;Real-time quantitative PCR

R.3647

：A

：1008-4118（2013）02-0008-03

10.3969/j.issn.1008-4118.2013.02.03

2013-03-29