河南省煙草赤星病病原鑒定

祖艷青，蔣士君，王海濤，孫淑君，張猛

1河南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，鄭州 450002；

2河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，許昌 461000

煙草赤星病(tobacco brown spot)是煙草生長(zhǎng)后期主要的葉部病害，在世界各煙草產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生[1]。我國(guó)在1916年首次在北京附近發(fā)現(xiàn)該病害，1964年在山東煙區(qū)大流行，損失巨大，隨后此病在全國(guó)各煙區(qū)日趨嚴(yán)重[2]。煙草赤星病典型癥狀是葉片發(fā)病初期為褐色小斑點(diǎn)，以后逐漸擴(kuò)大為1～2 cm，深褐色至赤褐色，圓形或不規(guī)則圓形，擴(kuò)展中的病斑周圍常有淡黃色暈圈，病斑具多重同心輪紋，病斑質(zhì)脆易破。病害嚴(yán)重時(shí)，許多病斑相互連接愈合成大斑塊枯焦[3]。

已報(bào)道的國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究對(duì)此病病原菌種的看法不一，最初報(bào)道該病害病原名稱是Macrosporium longipes Ellis & Everhart (1892)，后來(lái)由 Mason（1928）將其組合為Alternaria longipes (Ell.& Ev.) Mason[4]，這個(gè)名稱一直沿用到20世70年代。但Lucas 1971年著文認(rèn)為 A.longipes與 A.alternata（Fr.：Fr.）keissler在形態(tài)上是相同的[5]。此后，研究煙草赤星病的大量文獻(xiàn)中，就出現(xiàn)了A.alternata和A.longipes二名并用的混亂局面[5-8]。張?zhí)煊?998年將煙草赤星病菌鑒定為鏈格孢Alternaria alternata一個(gè)新的?；虯lternaria alternata (Fr.: Fr.) Keissler f.sp.nicotianae T.Y.Zhang et W.Q.Chen[9]。成巨龍，彭希文和關(guān)博元分別研究了陜西、云南和重慶地區(qū)的煙草赤星病菌，都認(rèn)為主要病原菌為鏈格孢菌(A.alternata)，僅在云南存在少量長(zhǎng)柄鏈格孢菌(A.longipes)，在陜西有少量Alternaria nicotianae[10-12]。Simmons和張?zhí)煊畹孺湼矜哞b定專家經(jīng)過(guò)多年的系統(tǒng)研究，完善了該屬分類鑒定系統(tǒng)和標(biāo)準(zhǔn)，并對(duì)長(zhǎng)柄鏈格孢菌(A.longipes)和鏈格孢菌(A.alternata)進(jìn)行了比較研究，認(rèn)為長(zhǎng)柄鏈格孢菌(A.longipes)是明顯區(qū)別于鏈格孢菌(A.alternata)等其他小孢子種的獨(dú)立存在的種[13-14]。

關(guān)于河南省煙草赤星病菌的鑒定，目前尚未有較系統(tǒng)的分類研究，僅有康業(yè)斌，陳瑞泰等認(rèn)為河南省煙草赤星病菌為Alternaria alternata[15-16]。對(duì)2011年和2012年河南省煙草赤星病病原的種類及其分布進(jìn)行較系統(tǒng)全面的調(diào)查研究，按照國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)鑒定并明確其病原種類，為防治研究提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌種的采集與分離

2011～2012 年煙草生長(zhǎng)中后期，分別在河南省南陽(yáng)、三門峽、駐馬店、許昌、洛陽(yáng)、鄭州六個(gè)市不同縣的煙草生產(chǎn)區(qū)采集煙草赤星病菌典型病斑，在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)分離菌株。

1.1.2 供試培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基（馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂粉15 g，蒸餾水定容至1000 mL）；PCA培養(yǎng)基（馬鈴薯20 g，胡蘿卜20 g，瓊脂粉15 g，蒸餾水定容至1000 mL）。

1.1.3 供試煙草品種

測(cè)定菌株致病性統(tǒng)一用的是烤煙品種中煙100，采集大小較均勻一致的旺長(zhǎng)期健康葉片，在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)做離體接種。

1.2 方法

1.2.1 菌種的分離

1.2.1.1 體視鏡下直接挑取單個(gè)孢子

有些新鮮采集的標(biāo)本可以直接在體視鏡下挑取單個(gè)孢子進(jìn)行分離；有些需要經(jīng)過(guò)保濕培養(yǎng)2天左右才能挑取單孢。在無(wú)菌條件下挑取單孢到PDA平板后置生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4～7天后，鏡檢保存純菌種，將保存的菌種于4 ℃冰箱中長(zhǎng)期保存。沒(méi)有得到純菌種的，重新單孢分離純化，直至得到純菌種。

1.2.1.2 組織分離法

用保濕培養(yǎng)方法挑取的單孢子并不能保證是病原菌，有時(shí)候可能是病斑上的腐生菌，此時(shí)，應(yīng)結(jié)合組織分離方法獲得病原菌相互驗(yàn)證。首先在病健交界處切下組織，放入75 %酒精消毒30 s，然后轉(zhuǎn)入3 % NaClO消毒約2 min，用無(wú)菌水清洗3次，保證表面雜菌清洗干凈，然后用滅過(guò)菌的濾紙將組織塊表面的水吸干，再用無(wú)菌手術(shù)刀將組織切成約0.5 cm2大小的小塊，分別放入PDA培養(yǎng)基平板上，在溫度（25±1）℃、相對(duì)濕度（75±2）%、光照/黑暗各12 h交替的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將分離菌株進(jìn)行單孢純化后，保存于4℃冰箱。

1.2.2 致病性測(cè)定

采集旺長(zhǎng)期新鮮健康煙葉，用75 %的酒精棉球?qū)熑~表面消毒，無(wú)菌水沖洗3次。用直徑為5 mm打孔器打菌塊，將菌絲塊輕貼于消過(guò)毒的煙葉表面，每片葉片以葉脈為分界，一邊針刺另一邊不針刺，針刺和未針刺分別接種10個(gè)位點(diǎn)。以同樣大小的無(wú)菌PDA塊作為對(duì)照接種于健康葉片上。接種后的煙葉置入消過(guò)毒的托盤內(nèi)，葉柄處要用無(wú)菌濕棉花包上使葉片處于保濕狀態(tài)，然后用保鮮膜封上托盤口，置于25℃室溫培養(yǎng)箱內(nèi)保濕培養(yǎng)5天，統(tǒng)計(jì)發(fā)病情況。

1.2.3 菌種的鑒定

1.2.3.1 形態(tài)鑒定

采用Simmons[14]鑒定鏈格孢屬的標(biāo)準(zhǔn)方法，將單孢分離并且經(jīng)柯赫氏法則驗(yàn)證的赤星病菌株接種到PCA平板上，置入培養(yǎng)條件為溫度（25±1）℃、相對(duì)濕度（75±2）%、光照/黑暗各12 h交替的生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5天，然后在無(wú)菌條件下刮掉PCA平板上面的菌絲，再次置入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～5天，在體視鏡下觀察菌株的產(chǎn)孢表型，顯微鏡下觀察分生孢子及分生孢子梗，產(chǎn)孢表型、分生孢子梗及分生孢子均拍照記錄。

檢測(cè)TAK-242與LFS-01協(xié)同作用對(duì)細(xì)胞活性的影響時(shí)，在JeKo-1細(xì)胞培養(yǎng)液中添加TAK-242，使其終濃度為0.5 nmol/L或1.0 nmol/L，之后以每孔3 000個(gè)細(xì)胞的密度將JeKo-1細(xì)胞鋪于96孔板中，然后添加LFS-01（濃度同LFS-01單藥組）。后續(xù)操作同上。

1.2.3.2 rDNA-ITS序列分子鑒定

在形態(tài)學(xué)鑒定的基礎(chǔ)上，分別選取Alternaria alternata、Alternaria longipes、Alternaria yaliin fi ciens 3個(gè)種對(duì)應(yīng)的代表菌株NC-110830-1-1、MC-110910-2-1、MC-110929-6-1的DNA為模板，以真菌核糖體基因轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS通用引物ITS1（5'-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G － 3'） 和 ITS4（5'-TCC TCC CGC TTA TTG ATA TGC－3'）兩條引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。

PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系：Taq PCR Master Mix (含0.1 U/μL Taq DNA polymerase，0.4 mmol/L each dNTP 2×Taq Buffer，PCR增強(qiáng)劑和蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑，商品目錄號(hào): PT103）12.5μL，上游引物（5μmol/L）和下游引物（5μmol/L）各1μL，模板DNA（10 ng/μL）1μL，ddH2O為9.5μL，總體積為25μL。

rDNA-ITS基因PCR反應(yīng)程序：先95 ℃預(yù)變性2 min，再 95 ℃ 30s→ 55 ℃ 30 s→ 72℃ 2min循環(huán)33次，最后72 ℃延伸7 min，4 ℃終止。

將PCR產(chǎn)物經(jīng)過(guò)電泳檢測(cè)之后送至上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序。將供試菌株測(cè)序結(jié)果與GenBank中已發(fā)表的部分鏈格孢rDNA ITS區(qū)序列進(jìn)行比較分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種的分離與致病性測(cè)定

從河南省南陽(yáng)、三門峽、駐馬店、許昌、洛陽(yáng)、鄭州六個(gè)市不同縣的煙草生產(chǎn)區(qū)共采集煙草赤星病病斑典型標(biāo)本300多份，分離得到85株鏈格孢屬菌株。經(jīng)室內(nèi)離體葉片接種，發(fā)病菌株有60株，各發(fā)病菌株的發(fā)病癥狀相似，接種點(diǎn)由褐色斑點(diǎn)逐漸擴(kuò)展成較規(guī)則褐色斑塊，邊緣多有黃色暈圈，且均從發(fā)病病斑再次分離到同一種菌株。圖1為3種鏈格孢代表種菌株的接種發(fā)病癥狀圖。

圖1 煙草赤星病病原接種發(fā)病癥狀

2.2 煙草赤星病菌的形態(tài)學(xué)鑒定

2.2.1 鏈格孢 Alternaria alternata （Fr.：Fr.）keissler

在PCA培養(yǎng)基上培養(yǎng)5天，形成具多重分枝矮樹(shù)狀的分生孢子鏈，支鏈一般長(zhǎng)1～5個(gè)孢子。分生孢子單生或短鏈生，卵形或橢圓形，淡褐色至褐色，具3～8個(gè)橫膈膜和1～4個(gè)縱、斜隔膜。短喙柱狀，淡褐色，部分轉(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)孢細(xì)胞（假喙）。卵形分生孢子10～30×5～12 μm；橢圓形孢子25～35×4～9 μm。(圖2)

2.2.2 長(zhǎng)柄鏈格孢Alternaria longipes (Ell.& Ev.) Mason

在PCA培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 d，形成的分生孢子鏈一般有10～15個(gè)孢子，多數(shù)分生孢子長(zhǎng)鏈不分支，但有的也偶有分支，罕生的側(cè)鏈一般較短（1～5個(gè)孢子）。分生孢子梗單生或簇生，有時(shí)會(huì)從產(chǎn)孢梗側(cè)端延伸形成1～3條分支產(chǎn)孢梗，在分支梗上形成單獨(dú)的分生孢子鏈。分生孢子倒棍棒形或卵形，12～38×8～16 μm，淡褐色至中褐色，成熟分生孢子具3～4個(gè)橫膈膜，0～4個(gè)縱或斜隔膜。部分孢子頂端延伸形成長(zhǎng)至50～60 μm的次生分生孢子梗（假喙），孢身和假喙分界較明顯。(圖3)

2.2.3 鴨梨鏈格孢Alternaria yaliin fi ciens R.G.Roberts

在PCA培養(yǎng)基上培養(yǎng)5天，形成分生孢子主鏈長(zhǎng)8～18個(gè)孢子，每條主鏈有2～5個(gè)短分枝，每個(gè)短分枝有1～4個(gè)分生孢子。分生孢子多為卵形或橢圓形，頂部具次級(jí)分生孢子梗，少數(shù)為倒棍棒狀或窄卵形，頂部逐漸變?yōu)殄F形。在一個(gè)長(zhǎng)鏈中幾乎含有以上各種類型形狀的孢子，在長(zhǎng)鏈的下部孢子較大，上部的孢子較小。卵形的分生孢子，具3～4個(gè)橫隔膜，1～3個(gè)縱或斜隔膜，表面光滑，20～30×10～12 μm。倒棍棒狀的分生孢子30～50×8～13 μm。（圖4）

圖2 鏈格孢的產(chǎn)孢表型，分生孢子梗及分生孢子

圖3 長(zhǎng)柄鏈格孢的產(chǎn)孢表型，分生孢子梗及分生孢子

圖4 鴨梨鏈格孢的產(chǎn)孢表型，分生孢子梗及分生孢子

2.3 ITS序列分子鑒定結(jié)果

3個(gè)供試菌株NC-110830-1-1、MC-110910-2-1、MC-110929-6-1 分別擴(kuò)增出575、575、572 bp的單一片段，將所得序列兩端引物及部分的18S和28S序列剪去后得到5.8S rDNA-ITS區(qū)完整序列，片段均為480 bp的一條特異性條帶。

將供試菌株測(cè)序結(jié)果與在GenBank中搜索的Alternaria alternata（菌株E.G.S 34-016，GenBank接受號(hào)為FJ717729.1）、 Alternaria longipes(菌株E.G.S 30-033,GenBank接受號(hào)為AY751457.1) 和 Alternaria yaliin fi ciens（菌株R.G.R 01.0204,GenBank接受號(hào)為FJ717729.1）的rDNA-ITS序列進(jìn)行比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)GenBank中搜索的三個(gè)菌株的5.8S rDNA-ITS序列完全一致，供試菌株NC-110830-1-1、MC-110910-2-1與搜索的序列相似度也高達(dá)100%，僅有菌株MC-110929-6-1的序列5.8S區(qū)位點(diǎn)173處由A→C，其他位點(diǎn)完全一致。說(shuō)明在形態(tài)上鑒定為不同種的小孢子鏈格孢種的5.8S rDNA-ITS序列過(guò)于保守，不能用于這些種的鑒定。

3 結(jié)論與討論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，河南省煙草赤星病菌組成復(fù)雜，目前至少有3個(gè)種，分別是Alternaria alternata、Alternaria longipes、Alternaria yaliinficiens。其中Alternaria alternata 在已報(bào)道的關(guān)于煙草赤星病菌的文獻(xiàn)中是較常見(jiàn)的種，而Alternaria longipes較少有報(bào)道，特別是Alternaria yaliin fi ciens至今未見(jiàn)有寄生在煙草上的報(bào)道。

鏈格孢屬真菌屬級(jí)特征醒目，而種級(jí)特征隨條件變異較大，特別是小孢子鏈格孢種的準(zhǔn)確鑒定比較困難，在病原鑒定時(shí)必須先進(jìn)行單孢分離、純化后嚴(yán)格的按現(xiàn)代鏈格孢分類國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)方法才能準(zhǔn)確鑒定[13-14]。

在分子水平上，Alternaria alternata、Alternaria longipes、Alternaria yaliin fi ciens在 5.8S rDNA-ITS區(qū)域序列都沒(méi)有明顯差異，說(shuō)明它們?cè)谶z傳上是很接近的自然群體。這與王洪凱（2001）、胡中會(huì)（2012）等報(bào)道的結(jié)果一致[17-18]，因此5.8S rDNA-ITS區(qū)域不適合小孢子鏈格孢種的分子鑒定。在以后的研究中需要繼續(xù)篩選合適的基因來(lái)區(qū)分鏈格孢屬不同的種。

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