庫普弗細(xì)胞與非酒精性脂肪性肝病關(guān)系的研究進(jìn)展

黃 超，陳源文，徐雷鳴

1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院消化內(nèi)鏡診治部，上海200092;2.上海市小兒消化與營養(yǎng)重點實驗室

非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)是一種無過量飲酒史，以肝實質(zhì)細(xì)胞脂肪變性和脂肪貯積為特征的臨床病理綜合征，主要包括單純性脂肪肝、脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis，NASH)、脂肪性肝纖維化和肝硬化。單純的肝脂肪變性雖是NAFLD的良性表現(xiàn)，但很多病例仍可進(jìn)展成為脂肪性肝炎甚至肝硬化、肝細(xì)胞癌。然而，其發(fā)病機(jī)制尚未完全明確。

庫普弗細(xì)胞(Kupffer cells，KCs)位于肝竇內(nèi)，可第一時間接觸隨入肝血流而來的各種物質(zhì)分子，其主要作用為吞噬、清除固體顆粒;處理并遞呈抗原激發(fā)獲得性免疫;分泌炎癥介質(zhì)，募集炎癥細(xì)胞使之在肝臟聚集等。最近發(fā)現(xiàn)肥胖患者脂肪組織與肝組織的共同病理變化可歸因于巨噬細(xì)胞的作用，而且越來越多的證據(jù)表明庫普弗細(xì)胞在NAFLD進(jìn)展過程中發(fā)揮了決定性的作用。

1 KCs與脂質(zhì)沉積

有研究顯示，肥胖、2型糖尿病、高脂血癥等伴隨的瘦素及胰島素抵抗，可引起呈良性經(jīng)過的肝內(nèi)脂肪堆積(單純性脂肪肝)。Huang等［1］報道KCs干擾肝細(xì)胞脂質(zhì)代謝以及對胰島素的敏感性，這一作用可能主要由腫瘤壞死因子α(Tumor necrosis factor，TNF-α)介導(dǎo)。研究發(fā)現(xiàn)，抑制KCs可對抗飲食誘導(dǎo)的胰島素抵抗和肝脂肪變性;TNF-α缺失或TNF-α受體缺失的肥胖小鼠對胰島素的敏感性較對照組提高［2］。而KCs是肝臟局部TNF-α的主要來源。可見，KCs在胰島素抵抗相關(guān)的脂肪沉積起重要作用。然而，KCs在NAFLD的早期可能并不起關(guān)鍵作用。Li等［3］對Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)野生型和TLR4敲除小鼠靜脈注射三氯化釓抑制后，飼以高脂飲食。結(jié)果顯示，抑制KCs對TLR4野生型小鼠肝臟甘油三酯沉積、肝內(nèi)游離脂肪酸的濃度下降和早期血清ALT改善均不明顯。

肝組織脂質(zhì)成分及其含量的改變也可通過若干機(jī)制調(diào)節(jié)庫普弗細(xì)胞的生物學(xué)活動。脂肪堆積的肝細(xì)胞占據(jù)肝內(nèi)空間，致肝竇灌流不足，白細(xì)胞被困在狹窄的肝竇內(nèi)，使庫普弗細(xì)胞參與微血管炎癥反應(yīng)的可能性增加［4］。庫普弗細(xì)胞過度暴露于脂肪酸后可通過細(xì)胞表面受體及胞內(nèi)介質(zhì)來調(diào)節(jié)炎癥和胰島素抵抗通路［5］。過多或異常的脂質(zhì)會干擾機(jī)體對脂肪變肝細(xì)胞的識別，從而促進(jìn)脂肪變肝細(xì)胞與庫普弗細(xì)胞之間發(fā)生不利的相互作用［6］。

2 KCs在單純性脂肪肝進(jìn)展為脂肪性肝炎過程中的作用

2.1 KCs與 TLR4 Toll樣受體(Toll-like receptor，TLR)是一種Ⅰ型跨膜受體，可通過識別和介導(dǎo)病原相關(guān)分子模式和結(jié)合內(nèi)源性配體，從而激活細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，進(jìn)一步導(dǎo)致炎癥發(fā)生。TLR家族包括多個成員，其中與NAFLD密切相關(guān)的是TLR4。脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)/內(nèi)毒素能夠作為配體與 TLR4相結(jié)合，隨后通過TLR4的胞內(nèi)TIR(Toll/IL-1 receptor)結(jié)構(gòu)域與骨髓分化因子88(MyD88)的羧基端相結(jié)合，促進(jìn) c-Jun氨基端蛋白激酶(INK)和核因子-κB(NF-κB)等轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)，從而引起一系列炎性細(xì)胞因子和化學(xué)因子的釋放，如白細(xì)胞介素IL-6、IL-1、IL-8、IL-12、IL-18 和 TNF-α。IL-6、IL-1 和 IL-8 可激活并促使中性粒細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞等炎癥細(xì)胞到達(dá)炎癥部位。此外，游離脂肪酸也能作為TLR的配體，經(jīng)TLR4/MyD88信號通路，促使炎癥因子的釋放［7］。

肝內(nèi)TLR4主要位于KCs細(xì)胞表面。Ye等［8］明確指出肝巨噬細(xì)胞TLR4的激活是脂肪性肝炎發(fā)生的關(guān)鍵步驟。Soares等［9］也認(rèn)為TLR4是內(nèi)毒素最重要的受體，它是酒精性肝病和非酒精性肝病發(fā)生肝臟炎癥的關(guān)鍵介質(zhì)。X盒結(jié)合蛋白1(X-box binding protein-1，XBP-1)是重要的轉(zhuǎn)錄因子，可直接與炎癥基因(TNF-α、IL-6)的啟動子區(qū)域相互作用，其作為 TLR4的下游效應(yīng)器，在高脂高膽固醇飲食誘導(dǎo)的肝臟炎癥和損傷過程中發(fā)揮作用。Ye等［8］在其研究中發(fā)現(xiàn)，腺病毒介導(dǎo)的XBP-1表達(dá)沉默對高脂高膽固醇飲食誘導(dǎo)的肝脂質(zhì)沉積并無影響;而引起NF-κB激活減弱、細(xì)胞因子產(chǎn)生減少、肝損傷減輕等現(xiàn)象，提示XBP-1主要參與單純性脂肪變向脂肪性肝炎的轉(zhuǎn)變。另一重要發(fā)現(xiàn):TLR4表達(dá)上調(diào)的同時伴有脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物的增加，說明LPS與TLR4的相互作用還可引起氧化應(yīng)激。Ye等［8］還指出 TLR4與活性氧(reactive oxygen species，ROS)之間存在正反饋調(diào)節(jié)，對炎癥的起始和擴(kuò)大起重要作用。用抗氧化劑或TLR4基因抑制劑處理原代KCs后，LPS無法誘導(dǎo)其炎癥反應(yīng)，該結(jié)果為以上觀點提供了有力依據(jù)。因此，有理由認(rèn)為TLR4與ROS兩條信號通路在XBP-1匯合，從而加強(qiáng)炎癥反應(yīng)。此外，Miura等［10］在其建立的小鼠NASH模型中，發(fā)現(xiàn)TLR9信號通路可促使KCs分泌IL-1β，從而導(dǎo)致肝脂肪變、炎癥，甚至纖維化。

2.2 KCs的經(jīng)典/替代激活 目前已證實有不同巨噬細(xì)胞亞型的存在，最具特征性的巨噬細(xì)胞是經(jīng)典激活巨噬細(xì)胞(classically activated macrophages，caMφ)，其可在輔助性T細(xì)胞1型(Th1)分泌因子(γ-干擾素和腫瘤壞死因子)環(huán)境中被細(xì)菌脂多糖及炎性物質(zhì)和(或)微生物激活。同時，巨噬細(xì)胞在Th2細(xì)胞因子環(huán)境中發(fā)育成為一種不同于caMφ激活程序的巨噬細(xì)胞，這種類型被稱為替代激活巨噬細(xì)胞 (alternatively activated macrophages，aaMφ)?，F(xiàn)有研究顯示，非肥胖小鼠脂肪組織巨噬細(xì)胞為M2表型，而肥胖小鼠巨噬細(xì)胞呈現(xiàn) M1 表型［11］。

2.2.1 KCs的經(jīng)典激活:M1/經(jīng)典激活巨噬細(xì)胞擅長遞呈抗原，誘導(dǎo)細(xì)胞因子(IL-6、IL-12、TNF-α、IL-23)的大量釋放，激活Th1應(yīng)答(促炎);M1巨噬細(xì)胞還能產(chǎn)生ROS［11］。已知LPS能誘導(dǎo)KCs發(fā)生經(jīng)典激活。Huang等［1］采用LPS和游離脂肪酸處理與KC共培養(yǎng)的肝細(xì)胞和單獨培養(yǎng)的肝細(xì)胞(KCs與肝細(xì)胞從同一大鼠肝臟分離所得)，隨后分析肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)代謝情況和胰島素生理作用。結(jié)果顯示，當(dāng)與KC共培養(yǎng)時，肝細(xì)胞內(nèi)甘油三酯增多，脂肪酸酯化增加，脂肪酸氧化減少;而單獨培養(yǎng)的肝細(xì)胞在相同處理后，其甘油三酯聚集，脂肪酸酯化和脂肪酸氧化幾乎沒有變化。胰島素可促使胰島素受體磷酸化及絲氨酸/蘇氨酸激酶磷酸化，激活胰島素受體底物-1(IRS-1)和磷脂酰肌醇3激酶(PI-3K)活性，而KCs的M1型激活導(dǎo)致胰島素以上功能明顯下調(diào)。以上研究結(jié)果說明:KCs在NAFLD發(fā)展過程中發(fā)揮了重要作用。這同時也說明，KCs與肝實質(zhì)細(xì)胞之間的相互作用在調(diào)節(jié)肝代謝方面至關(guān)重要。

2.2.2 KCs的替代激活在NAFLD中的作用:M2/替代激活巨噬細(xì)胞由IL-13和IL-4誘導(dǎo)產(chǎn)生，促進(jìn)Th2應(yīng)答(抗炎);M2巨噬細(xì)胞高表達(dá)抗炎細(xì)胞因子IL-1和IL-10受體。因此，與巨噬細(xì)胞經(jīng)典激活相反，巨噬細(xì)胞替代激活代表了一條重要的炎癥反應(yīng)消散通路。Kang等［12］發(fā)現(xiàn)脂肪細(xì)胞和肝細(xì)胞是Th2細(xì)胞因子的重要來源。Th2細(xì)胞因子促使過氧化物酶體增殖物激活受體 δ (peroxisome proliferator-activated receptor δ，PPARδ)作用于巨噬細(xì)胞，使其發(fā)生替代激活，這對減輕白色脂肪組織和肝臟炎癥非常重要，而這一重要的調(diào)節(jié)環(huán)路在肝脂肪變時發(fā)生改變［13］。飽和脂肪酸可與TLR4結(jié)合促進(jìn)巨噬細(xì)胞的M1型(促炎)激活［14］;而單不飽和脂肪酸可通過PPARδ促進(jìn)巨噬細(xì)胞替代激活［15］，NAFLD時因脂質(zhì)內(nèi)穩(wěn)態(tài)和肝細(xì)胞微環(huán)境改變，此調(diào)節(jié)作用同樣失衡［3］。也就是說，NAFLD發(fā)生后巨噬細(xì)胞替代激活受抑制，無法發(fā)揮其促進(jìn)炎癥消退的作用。

近年來，許多研究證明PPARδ在介導(dǎo)巨噬細(xì)胞替代激活中發(fā)揮重要作用。Odegaard等［13］在其研究中發(fā)現(xiàn):(1)非肥胖動物敲除PPARδ基因后，替代激活KCs標(biāo)記物表達(dá)下調(diào);(2)將PPARδ-/-骨髓移植到野生型小鼠可減少替代激活KCs，從而導(dǎo)致肝細(xì)胞線粒體功能障礙和胰島素抵抗;(3)PPARδ-/-巨噬細(xì)胞與原代肝細(xì)胞共同培養(yǎng)后，明顯抑制了肝細(xì)胞氧化代謝。Kang等［12］報道髓細(xì)胞特異性 PPARδ-/-小鼠可出現(xiàn)脂肪細(xì)胞功能紊亂、胰島素抵抗、肝脂肪變性。Huang等［1］也認(rèn)為PPARδ缺失使肥胖人群更易發(fā)生胰島素抵抗、肝脂肪變性、肝細(xì)胞氧化代謝降低。這些重要發(fā)現(xiàn)不禁讓人猜想，是否可以通過加強(qiáng)PPARδ對KCs的特定靶向作用，引起KCs替代激活，從而改善NAFLD炎癥反應(yīng)和脂肪變性。

2.3 KCs功能障礙 Asanuma等［16］報道通過超順磁氧化鐵(SPIO)磁共振成像技術(shù)發(fā)現(xiàn)，在KCs數(shù)目不減少的情況下，NAFLD患者和NASH動物模型中KCs吞噬功能明顯受損，且其功能受損程度與肝脂肪變性程度呈正比。該發(fā)現(xiàn)提示，KCs對LPS及其他有害分子清除障礙可加重肝損傷，這一機(jī)制也需在NAFLD發(fā)病中受到關(guān)注。

研究表明，腸源性內(nèi)毒素血癥可能是NAFLD發(fā)生發(fā)展的一個重要原因。肝細(xì)胞膜上有內(nèi)毒素及LPS類脂A受體，所以內(nèi)毒素可與其受體結(jié)合直接作用于肝細(xì)胞引起肝臟損害。但脂肪性肝病時，內(nèi)毒素對肝臟的損害主要通過TLR4激活KC，促進(jìn)TNF-α等多種細(xì)胞因子和化學(xué)因子的轉(zhuǎn)錄、合成與釋放，引起肝臟的炎癥損害［17］。內(nèi)毒素還可激活補(bǔ)體系統(tǒng)，使其釋放過敏毒素C3a和C5a，后兩者分別與KCs上相應(yīng)受體(C3aR、C5aR)結(jié)合而激活 KCs［18］。

KCs作為入肝血流的第一道防線，其攝取功能減弱，不僅使體循環(huán)內(nèi)毒素水平增高，而且持續(xù)刺激KCs來源細(xì)胞因子(TNF-α、IL-β)過度產(chǎn)生，從而不斷放大內(nèi)毒素的作用。

2.4 其他 殼丙糖酶(Chitotriosidase，CHIT)主要由活化巨噬細(xì)胞產(chǎn)生;在肝臟，其只表達(dá)在 KCs。Malaguarnera等［19］發(fā)現(xiàn)NASH 患者 KCs中 CHIT表達(dá)明顯高于單純性脂肪肝患者，且CHIT表達(dá)水平與NASH嚴(yán)重程度呈正比。因此，不妨大膽假設(shè)CHIT可能會成為NASH疾病嚴(yán)重程度新一代標(biāo)記物。

3 KCs與脂肪性肝纖維化

Yang等［20］在其建立的脂肪性肝纖維化模型中發(fā)現(xiàn)肝內(nèi)源性大麻素水平明顯增高，而該種物質(zhì)的升高與肝纖維化發(fā)生和肝內(nèi)阻力的增加有關(guān)。用三氯化釓抑制KCs，可減少內(nèi)源性大麻素的生成。Yang等［20］所建立的模型除了有典型高瘦素血癥外，還伴有活化白細(xì)胞增加以及TNF-α/p38MAPK表達(dá)上調(diào)。高瘦素血癥可引起白細(xì)胞激活，活化白細(xì)胞通過TNF-α/MAPK通路釋放內(nèi)源性大麻素。有文獻(xiàn)報道瘦素可通過p38MAPK通路增加 KCs對 TNF-α的分泌［21］。因此，高瘦素血癥很可能與內(nèi)源性大麻素的增高有關(guān)，而KCs或許參與了瘦素對肝內(nèi)源性大麻素的調(diào)節(jié)，但其具體機(jī)制還有待進(jìn)一步的研究。

Malaguarnera等［19］報道，單純性脂肪肝患者和NASH患者KCs的 CHIT mRNA水平與氧離子、脂質(zhì)過氧化反應(yīng)、TNF-α及鐵蛋白水平顯著相關(guān)。此外，受檢人員中肝臟鐵沉積最嚴(yán)重的患者其CHIT表達(dá)也最高。美國NASH臨床協(xié)作網(wǎng)對849例資料完整的NAFLD患者進(jìn)行肝活檢標(biāo)本鐵染色發(fā)現(xiàn)，293例(34.5%)患者有鐵沉積，其中63例為肝細(xì)胞模式、91例網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)模式、139例混合模式鐵沉積。網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)模式較其他模式鐵沉積患者，肝細(xì)胞氣球樣變、匯管區(qū)炎癥、NASH及其進(jìn)展性肝纖維化更常見，內(nèi)皮網(wǎng)狀系統(tǒng)鐵沉積與進(jìn)展性肝纖維化的相關(guān)性獨立于年齡、性別、BMI和 DM［22］。因此，繼發(fā)性鐵沉積與KCs之間存在何種聯(lián)系，又在NAFLD中發(fā)揮何種作用，值得研究。

4 KCs對NAFLD肝臟再生的影響

業(yè)已證實TNF-α和IL-6是肝臟再生早期信號通路的重要信使，而這兩者都由KCs分泌。另一方面，促進(jìn)TNF-α生成的因素大都加劇肝損傷，而TNF-α的抑制劑則具有保肝效果［23］;Hsiao等［24］在其研究中發(fā)現(xiàn)NAFLD模型肝再生能力減弱，肝細(xì)胞功能惡化，這可能與KCs介導(dǎo)細(xì)胞因子如 TNF-α、IL-1、IL-10等表達(dá)紊亂相關(guān)。因此，KCs在NAFLD肝再生方面的作用仍存在爭議。

5 結(jié)語

盡管近年來NAFLD領(lǐng)域的研究已經(jīng)取得一定進(jìn)展，但目前對NAFLD發(fā)病機(jī)制了解仍十分有限。KCs雖然已經(jīng)證實是參與NAFLD進(jìn)展的重要細(xì)胞，但目前對其在NAFLD中的功能仍需要系統(tǒng)研究，加深認(rèn)識和減少爭議，最終不僅有利于NAFLD機(jī)制進(jìn)一步闡明，還為NAFLD防治提供新的研究思路和靶點。

［1］Huang W，Metlakunta A，Dedousis N，et al.Depletion of liver Kupffer cells prevents the development of diet-induced hepatic steatosis and insulin resistance［J］.Diabetes，2010，59(2):347-357.

［2］Yamoto M，Shiba T，Ide T，et al.High-fat diet-induced obesity and insulin resistance were ameliorated via enhanced fecal bile acid excre-tion in tumor necrosis factor-alpha receptor knockout mice ［J］.Mol Cell Biochem，2012，359(1-2):161-167.

［3］Li L，Chen L，Hu L，et al.Nuclear factor high-mobility group box1 mediating the activation of Toll-like receptor 4 signaling in hepatocytes in the early stage of nonalcoholic fatty liver disease in mice［J］.Hepatology，2011，54(5):1620-1630.

［4］Farrell GC，Teoh NC，McCuskey RS.Hepatic microcirculation in fatty liver disease［J］.Anat Rec(Hoboken)，2008，291(6):684-692.

［5］Kim JK.Fat uses a TOLL-road to connect inflammation and diabetes［J］.Cell Metab，2006，4(6):417-419.

［6］Maher JJ，Leon P，Ryan JC.Beyond insulin resistance:Innate immunity in nonalcoholic steatohepatitis［J］.Hepatology，2008，48(2):670-678.

［7］Mencin A，Kluwe J，Schwabe RF，et al.Toll-like receptors as targets in chronic liver diseases［J］.Gut，2009，58(5):704-720.

［8］Ye D，Li FY，Lam KS，et al.Toll-like receptor-4 mediates obesity-induced non-alcoholic steatohepatitis through activation of X-box binding protein-1 in mice［J］.Gut，2012，61(7):1058-1067.

［9］Soares JB，Pimenel-Nunes P，Roncon-Albuquerque R，et al.The role of lipopolysaccharide/toll-like receptor 4 signaling in chronic liver diseases［J］.Hepatol Int，2010，4(4):659-672.

［10］Miura K，Kodama Y，Inokuchi S，et al.Toll-like receptor 9 promotes steatohepatitis by induction of interleukin-1β in mice［J］.Gastroenterology，2010，139(1):323-334.

［11］Zhan YT，An W.Roles of liver innate immune cells in nonalcoholic fatty liver disease［J］.World J Gastroenterol，2010，16(37):4652-4660.

［12］Kang K，Reilly SM，Karabacak V，et al.Adipocyte-derived Th2 cytokines and myeloid PPARδregulate macrophage polarization and insulin sensitivity［J］.Cell Metab，2008，7(6):485-495.

［13］Odegaard JI，Ricardo-Gonzalez RR，Red Eagle A，et al.Alternative M2 activation of kupffer cells by PPARδ ameliorates obesity-induced insulin resistance［J］.Cell Metab，2008，7(6):496-507.

［14］Kim F，Pham M，Luttrell I，Bannerman DD，et al.Toll-like receptor-4 mediates vascular inflammation and insulin resistance in diet-induced obesity［J］.Circ Res，2007，100(11):1589-1596.

［15］Baffy G.Kupffer cells in non-alcoholic fatty liver disease:the emerging view ［J］.J Hepatol，2009，51(1):212-223.

［16］Asanuma T，Nno M，Kubota K，et al.Super paramagnetic iron oxide MRI shows defective Kupffer cell uptake function in non-alcoholic fatty liver disease［J］.Gut，2010，59(2):258-266.

［17］Li S，Wu WC.Research progress of relationship between endotoxin and fatty liver［J］.Int J Dig Dis，2007，27(3):205-207.李生，吳萬春.內(nèi)毒素與脂肪肝的關(guān)系研究進(jìn)展［J］.國際消化病雜志，2007，27(3):205-207.

［18］Zheng ZY，Weng SY，Yu Y.Signal molecule-mediated hepatic cell communication during liver regeneration ［J］.World J Gastroenterol，2009，15(46):5776-5783.

［19］Malaguarnera L，Di Rosa M，Zambito AM，et al.Chitotriosidase gene expression in Kupffer cells from patients with non-alcoholic fatty liver disease［J］.Gut，2006，55(9):1313-1320.

［20］Yang YY，Tsai TH，Huang YT，et al.Hepatic endothelin-1 and endocannabinoids-dependent effects of hyperleptinemia in nonalcoholic steatohepatitis-cirrhotic rats［J］.Hepatology，2012，55(5):1540-1550.

［21］Syn WK，Choi SS，Liakou E，et al.Osteopontin is induced by hedgehog pathway activation and promotes fibrosis progression in nonalcoholic steatohepatitis［J］.Hepatology，2011，53(1):106-115.

［22］Fan JG，Shi JP.Research progress of epidemiology and non-invasive diagnosis of non-alcoholic fatty liver disease in 2011［J］.J Clin Hepatol，2012，15(2):81-83.范建高，施軍平.2011年非酒精性脂肪性肝病流行病學(xué)與無創(chuàng)診斷研究進(jìn)展［J］.實用肝臟病雜志，2012，15(2):81-83.

［23］Vetel?inen R，Van Vliet AK，Van Gulik TM.Severe steatosis increases hepatocellular injury and impairs liver regeneration in a rat model of partial hepatectomy［J］.Ann Surg，2007，245(1):44-50.

［24］Hsiao IT，Lin KJ，Chang SI，et al.Impaired liver regeneration of steatotic rats after portal vein ligation:a particular emphasis on(99m)Tc-DISIDA scintigraphy and adiponectin signaling ［J］.J Hepatol，2010，52(4):540-549.