氣相－質(zhì)譜聯(lián)用法檢測(cè)花椒揮發(fā)油條件優(yōu)化的研究

羅 凱 黃秀芳 胡 江 王洪偉 闞建全

(西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院1，重慶 400716)

(重慶市農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室2，重慶 400716)

(重慶三峽學(xué)院生命科學(xué)與工程學(xué)院3，重慶 404000)

花椒是指蕓香科植物花椒(Zanthosylum Bungeanum Maxim)和青椒(Zanthoxylum Schinifolium Sieb．et Zucc．)的干燥成熟果皮[1]。我國(guó)是世界上種植花椒面積最大的國(guó)家，有45種13變種，較常見的約18種，分布于全國(guó)20多個(gè)省份，以南部各省區(qū)最多，尤其是川西南地區(qū)[1]。花椒的果實(shí)、根、莖和葉都可作藥用[2]。作為一種重要的香料和藥用經(jīng)濟(jì)作物，花椒種植規(guī)模每年以20%～30%的速度遞增，目前種植面積已經(jīng)超過12萬(wàn)公頃，形成了一個(gè)年產(chǎn)值達(dá)40億元左右的巨大特色農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)業(yè)[3]，并形成了陜西的韓城、甘肅的武都和秦安、山東的萊蕪、山西的芮域、四川的金陽(yáng)和漢源、重慶的江津等全國(guó)聞名的花椒種植基地[4]。

花椒的香氣成分來(lái)自于其組織中所含的揮發(fā)油[5]。揮發(fā)油是由萜烯等有機(jī)化合物及其含氧衍生物醇、醛、酮、酯等成分組成[6]，是一種揮發(fā)性的油狀物質(zhì)。對(duì)于花椒揮發(fā)油的檢測(cè)文獻(xiàn)有一些報(bào)道[7]，也有文獻(xiàn)報(bào)道用GC－MS方法進(jìn)行檢測(cè)[8]，但都是采用現(xiàn)有的檢測(cè)條件，鮮有文獻(xiàn)報(bào)道對(duì)于花椒揮發(fā)油GC－MS檢測(cè)方法的優(yōu)化。本試驗(yàn)對(duì)花椒揮發(fā)油GC－MS檢測(cè)條件進(jìn)行了優(yōu)化研究，旨在為花椒揮發(fā)油的檢測(cè)提供更加科學(xué)的檢測(cè)方法，為花椒化學(xué)成分分析以及品質(zhì)鑒定提供檢測(cè)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

花椒:采集新鮮花椒果實(shí)，放入恒溫鼓風(fēng)干燥箱烘干(45℃)至殼籽分離，取果皮做為試驗(yàn)樣品。

1.2 主要儀器設(shè)備

GC－MS QP2010氣相質(zhì)譜聯(lián)用儀:日本島津公司；FA2004電子天平上海精科有限公司；KQ3200DB超聲波清洗器:昆山市超聲儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 供試品溶液的制備:將干燥花椒粉碎過40目，準(zhǔn)確稱取10 g(準(zhǔn)確到0.000 1g)放入2 L圓底燒瓶中，加入500 mL純水和數(shù)粒玻璃珠，連接同時(shí)蒸餾萃取器，取40 mL無(wú)水乙醚加入500 mL平底燒瓶中連接在同時(shí)蒸餾萃取器另一端，40℃水浴加熱，連續(xù)萃取3 h后，向平底燒瓶中加入5 g無(wú)水硫酸鈉，冷凍(－18℃)過夜，過濾后將提取的花椒揮發(fā)油于50 mL容量瓶中，用無(wú)水乙醚稀釋至刻度，即為供試樣品溶液。

1.3.2 色譜條件的優(yōu)化

色譜柱考察:取樣品供試液，分別用Rtx－5MS毛細(xì)管柱(0.25μm×30 m×0.25 mm，5%的二苯基－95%二甲基聚硅氧烷固定相)和Rtx－Wax毛細(xì)管柱(0.25μm×30 m×0.32 mm，100%聚乙二醇固定相)，進(jìn)樣1μL進(jìn)行GC－MS分析；分流比考察:取樣品供試液進(jìn)樣1μL，分別在分流比10、25、50條件下進(jìn)行GC－MS分析；升溫程序考察:取樣品供試液，對(duì)升溫程序進(jìn)行考察。參考相關(guān)文獻(xiàn)[9－10]，并經(jīng)過初步篩選，對(duì)以下4種升溫程序進(jìn)行考察:①柱初始溫度為50℃，保持1 min，以1.5℃/min升至76℃，再以5℃/min升至150℃，然后以15℃/min升至240℃，保持5 min；②柱初始溫度為40℃，保持1min，以2℃/min升至65℃，再以10℃/min升至90℃，然后以2℃/min升至130℃，最后以5℃/min升至230℃，保持2 min；③柱初始溫度為40℃，保持1 min，以2℃/min升至65℃，再以10℃/min升至90℃，然后以3℃/min升至130℃，最后以8℃/min升至240℃，保持2 min；④柱初始溫度為40℃，保持1 min，以3℃/min升至65℃，再以10℃/min升至90℃，然后以 1.5℃/min升至 120℃，最后以10℃/min升至230℃，保持5 min；柱前壓與流速考察:柱前壓的不同導(dǎo)致載氣流速的不同，從而引起成分出峰時(shí)間的改變。取樣品供試液，在3種不同柱前壓40、50、60 kPa條件下進(jìn)行GC－MS分析；接口溫度考察:取樣品供試液，分別在200、230、250℃3種接口溫度下進(jìn)樣1μL進(jìn)行GC－MS分析；進(jìn)樣口溫度考察:取樣品供試液，分別在200、230、250℃3種進(jìn)樣口溫度下進(jìn)樣1μL進(jìn)行GC－MS分析；離子源溫度考察:取樣品供試液，分別在200、220、250℃3種離子源溫度下進(jìn)樣1μL進(jìn)行GC－MS分析。

1.3.3 方法學(xué)考察

精密度試驗(yàn):取樣品供試液，在相同的色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄其中10個(gè)共有色譜峰的保留時(shí)間和峰面積。以8號(hào)峰芳樟醇為參照峰(S)，計(jì)算圖譜中各個(gè)峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積，并計(jì)算它們之間的RSD值。

重復(fù)性試驗(yàn):取樣品花椒粉6份，按照以上方法制備成供試溶液，在相同的色譜條件下分別進(jìn)樣，記錄其中10個(gè)共有色譜峰的保留時(shí)間和峰面積。以8號(hào)峰芳樟醇為參照峰(S)，計(jì)算圖譜中各個(gè)峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積，并計(jì)算它們之間的RSD值。

穩(wěn)定性試驗(yàn):取樣品供試液，在相同的色譜條件下分別在供試液放置0、2、4、6、8、12、24 h時(shí)進(jìn)樣，記錄其中10個(gè)共有色譜峰的保留時(shí)間和峰面積。以8號(hào)峰芳樟醇為參照峰(S)，計(jì)算圖譜中各個(gè)峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積，并計(jì)算它們之間的RSD值。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理方法

所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用統(tǒng)計(jì)軟件DPS 9.5進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 氣相色譜質(zhì)譜條件的確定

2.1.1 色譜柱的選擇優(yōu)化結(jié)果

色譜柱檢測(cè)出的成分信息多少是衡量檢測(cè)柱優(yōu)越性的主要指標(biāo)。Rtx－5MS毛細(xì)管柱和Rtx－Wax毛細(xì)管柱分析的結(jié)果分別見圖1、圖2。比較圖1、圖2，在相同條件下，使用Rtx－Wax毛細(xì)管柱檢測(cè)出的成分信息明顯多于Rtx－5MS毛細(xì)管柱，故選用Rtx－Wax毛細(xì)管柱進(jìn)作為花椒揮發(fā)油氣相色譜檢測(cè)柱。

圖1 Rtx－5MS毛細(xì)管柱分析總離子色譜圖

圖2 Rtx－Wax毛細(xì)管柱分析總離子色譜圖

2.1.2 理想分流比優(yōu)化結(jié)果

在分流比為別為10、25、50條件下分析進(jìn)行樣品總離子色譜圖分析，結(jié)果見圖3，比較3種分流比條件下的總離子色譜圖，可以發(fā)現(xiàn)在分流比為25條件下所得圖譜較其他2種條件下的色譜圖更為理想。因此選擇分流比為25。

圖3 分流比10、25、50分析總離子色譜圖

2.1.3 升溫程序優(yōu)化結(jié)果

4種升溫程序分析結(jié)果見圖4，結(jié)果顯示以升溫程序④得到的色譜圖，峰型完整，信息較多，各成分分離程度良好，整體效果好于其他3種升溫程序，故選用升溫程序④進(jìn)行分析。

2.1.4 柱前壓與流速考察結(jié)果

在3種不同柱前壓40、50、60 kPa條件下分析，分析結(jié)果見圖5。比較3種條件下的總離子色譜圖可知，柱前壓為50 kPa，所對(duì)應(yīng)的流速為1.0 mL/min時(shí)，各主要成分色譜峰的分離效果較好，故確定柱前壓為50 kPa，流速為1.0 mL/min作為優(yōu)化柱前壓和流速。

圖4 升溫程序分析總離子色譜圖

圖5 柱前壓40、50、60kPa下分析總離子色譜圖

2.1.5 接口溫度考察結(jié)果

在3種接口溫度下，花椒揮發(fā)油中10種主要成分相對(duì)含量的RSD值均較小，說(shuō)明主成分的相對(duì)含量幾乎無(wú)差別，同時(shí)各主要成分色譜峰的分離效果較好，本試驗(yàn)確定以250℃為接口溫度。

2.1.6 進(jìn)樣口溫度考察結(jié)果

在3種進(jìn)樣口溫度下，花椒揮發(fā)油中10種主成分相對(duì)含量的RSD值均較小，說(shuō)明主成分的相對(duì)含量幾乎無(wú)差別，同時(shí)各主要成分色譜峰的分離效果較好，考慮到進(jìn)樣口溫度比樣品分析最高溫度約高20℃，最后確定以250℃為進(jìn)樣口溫度。

2.1.7 離子源溫度考察結(jié)果

在3種離子源溫度下，花椒揮發(fā)油中10種主成分相對(duì)含量的RSD值均較小，說(shuō)明主成分相對(duì)含量幾乎無(wú)差別，同時(shí)各主要成分色譜峰的分離效果較好，本試驗(yàn)確定以220℃為離子源溫度。

通過以上試驗(yàn)分析，最終確定了GC－MS分析花椒揮發(fā)油的最佳條件。氣相色譜條件:石英毛細(xì)管柱Rtx－Wax(0.25μm×30 m×0.32 mm，100%聚乙二醇固定相)；程序升溫，柱溫40℃，保持1 min，以3℃/min升至65℃，再以10℃/min升至90℃，然后以1.5℃/min升至120℃，最后以10℃/min升至230℃，保持5 min；分流比25:1；載氣為高純He，柱前壓為50 kPa，流速為 1.0 mL/min；進(jìn)樣口溫度250℃；接口溫度250℃；溶劑延遲時(shí)間2.5 min。質(zhì)譜條件:EI電子源，離子源溫度220℃，掃描范圍35～450 m/z，標(biāo)準(zhǔn)圖庫(kù) NIST05。

2.2 方法學(xué)考察結(jié)果

2.2.1 精密度試驗(yàn)結(jié)果

由表1統(tǒng)計(jì)結(jié)果分析可知，6次測(cè)定結(jié)果相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD均小于3%，說(shuō)明儀器精密度良好。

2.2.2 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

由表1統(tǒng)計(jì)結(jié)果分析可知，6次測(cè)定結(jié)果相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD均小于3%，說(shuō)明試驗(yàn)重復(fù)性良好。

2.2.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

由表 1統(tǒng)計(jì)結(jié)果分析可知，0、2、4、6、8、12、24 h測(cè)定結(jié)果相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD均小于3%，說(shuō)明樣品穩(wěn)定性良好。

表1 氣相色譜質(zhì)譜條件方法學(xué)考察結(jié)果/%

3 結(jié)論

本試驗(yàn)對(duì)花椒揮發(fā)油氣相色譜質(zhì)譜檢測(cè)方法的條件進(jìn)行了優(yōu)化。得到花椒揮發(fā)油氣相色譜質(zhì)譜檢測(cè)的最佳條件為:石英毛細(xì)管柱Rtx－Wax；程序升溫，柱溫40℃，保持1 min，以3℃/min升至65℃，再以10℃/min升至90℃，然后以1.5℃/min升至120℃，最后以10℃/min升至230℃，保持5 min；分流比25∶1；載氣為高純He，柱前壓為50 kPa，流速為1.0 mL/min；進(jìn)樣口溫度250℃；接口溫度250℃；溶劑延遲時(shí)間2.5 min。質(zhì)譜條件:EI電子源，離子源溫度220℃，掃描范圍35～450 m/z，標(biāo)準(zhǔn)圖庫(kù)NIST05。方法學(xué)考察顯示該條件下，其精密性、重復(fù)性和穩(wěn)定性良好。本試驗(yàn)結(jié)果為花椒揮發(fā)油的氣相色譜質(zhì)譜檢測(cè)與分析提供了試驗(yàn)依據(jù)，同時(shí)也為花椒品質(zhì)的鑒定提供了技術(shù)平臺(tái)。

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