均勻試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化酶法提取燕麥全粉蛋白質(zhì)研究

劉建壘 李英杰 郝利平

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，太谷 030801)

燕麥，學(xué)名Avena sativaL.，又被稱為莜麥、雀麥、玉麥、鈴鐺麥。燕麥被稱為“第三主糧”，現(xiàn)代研究表明燕麥具有降血脂、降血糖、免疫增強(qiáng)、抗氧化、益生等多種保健功能[1－2]，是美國《時(shí)代》?？扑]現(xiàn)代人十大最健康的食品之一。

燕麥中蛋白質(zhì)含量高達(dá)15%，在禾谷類糧食中居首位[3]，且同時(shí)具備人體8種必需氨基酸，其配比接近FAO/WHO推薦的模式；限制性氨基酸賴氨酸和色氨酸含量高[4－5]；燕麥蛋白質(zhì)凈利用率(NPU)達(dá)69.1～72.4；功效比(PER)達(dá)2.25～2.38；氨基酸分?jǐn)?shù)(AAS)高達(dá)68.2，生物價(jià)(BV)為 74.5～79.6，均是植物蛋白中的佼佼者[6－8]。

以往研究報(bào)道主要以燕麥麩為原料[3，9]，對(duì)燕麥全粉的研究較少，且多數(shù)用堿提酸沉法[10－11]，而酶法提取燕麥全粉蛋白的研究鮮見報(bào)道。與堿提酸沉法相比，酶法具有提取率高，反應(yīng)條件溫和，易于控制等優(yōu)點(diǎn)，且產(chǎn)品的營養(yǎng)價(jià)值及生物功能較優(yōu)[12]。本研究選用產(chǎn)量高、抗旱性好，適應(yīng)性強(qiáng)的燕麥新品種晉燕14號(hào)為研究對(duì)象，用均勻試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)酶法提取燕麥蛋白的工藝進(jìn)行優(yōu)化，以期為燕麥全粉中蛋白質(zhì)的提取和利用提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

燕麥:晉燕14號(hào)，山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院高寒區(qū)作物研究所(脫脂燕麥全粉中蛋白質(zhì)含量15.6%)。

堿性蛋白酶、中性蛋白酶、酸性蛋白酶:北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；中分子質(zhì)量蛋白Marker:北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 主要儀器與設(shè)備

KDN型定氮儀(HYP8.14.20孔消化裝置、2C型蒸餾裝置):上海釬檢儀器有限公司；JY－15A 750克多功能粉碎機(jī):永康市江業(yè)制造有限公司；UV－2100型紫外可見分光光度計(jì):尤尼柯(上海)儀器有限公司；pHS－25型數(shù)顯pH計(jì):上海精密科學(xué)儀器有限公司；JDG－0.2真空凍干試驗(yàn)機(jī):蘭州科近真空凍干技術(shù)有限公司；SHY－2A水浴恒溫振蕩器:江蘇金壇市金城國勝實(shí)驗(yàn)儀器廠；DYCZ－24D型電泳槽、DYY－6C型電泳儀:北京市六一儀器廠；Image LabTM4.0.1全自動(dòng)圖像獲取和分析軟件，Molecular Imager Gel DocTMXR＋成像系統(tǒng):美國Bio－Rad Laboratories公司等。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 工藝流程

脫脂燕麥全粉的制備:將新鮮燕麥清理后用JY－15A型多功能粉碎機(jī)粉碎30 s，用正己烷按1∶3(m/V)比例室溫下振蕩脫脂3 h，過濾，并用冷的正己烷沖洗3次，沖洗后置于通風(fēng)櫥中風(fēng)干，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

工藝流程:脫脂燕麥全粉→酶法提取→滅酶→離心→上清液等電點(diǎn)沉淀→離心→沉淀物→水洗至中性→真空冷凍干燥→燕麥蛋白。

1.3.2 酶制劑的篩選

試驗(yàn)所用蛋白酶及其反應(yīng)條件如表1所示。以0、20、40、60、80、100、120、140 U/g分別加入堿性蛋白酶、中性蛋白酶、酸性蛋白酶，液料比15∶1，調(diào)至各蛋白酶的適宜條件，恒溫水浴震蕩反應(yīng)60 min，85℃滅酶 10 min，4 000 r/min離心 15 min，測(cè)上清液中蛋白含量，計(jì)算蛋白提取率。

表1 試驗(yàn)所用蛋白酶的活性及反應(yīng)條件

1.3.3 均勻設(shè)計(jì)優(yōu)化酶法提取燕麥蛋白的工藝參數(shù)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果選擇試驗(yàn)條件，對(duì)加酶量、液料比、pH、浸提溫度、浸提時(shí)間進(jìn)行五因素十水平U10(1010)均勻設(shè)計(jì)[13]，因素水平表見表 2，以蛋白提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，確定酶法制備燕麥蛋白的最佳工藝條件。

表2 U10(1010)均勻試驗(yàn)因素水平表

1.3.4 燕麥蛋白等電點(diǎn)的確定

在得到的最佳提取條件下提取燕麥蛋白，取11等份蛋白提取上清液，分別用0.2 mol/L HCl緩慢調(diào)其 pH至 3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8，靜置6 h，4 000 r/min離心15 min，測(cè)定沉淀前后上清液中蛋白質(zhì)的含量，計(jì)算蛋白分離率。

1.3.5 測(cè)定與計(jì)算方法

固體中蛋白質(zhì)含量測(cè)定:凱氏定氮法，參照GB 5009.5—2010。

溶液中蛋白質(zhì)含量測(cè)定:Bradford法[14]，其標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

圖1 Bradford法測(cè)定蛋白含量標(biāo)準(zhǔn)曲線

蛋白質(zhì)提取率＝(提取液中蛋白質(zhì)的含量－添加酶中蛋白質(zhì)的含量)/(燕麥粉中蛋白質(zhì)的含量)×100%

產(chǎn)品純度＝固形物中總蛋白的質(zhì)量/總固形物質(zhì)量×100%

蛋白分離率＝(沉淀前上清液中蛋白含量－沉淀后上清液中蛋白含量)/(沉淀前上清液中蛋白含量)×100%

1.3.6 燕麥蛋白的SDS－PAGE電泳分析

采用5%濃縮膠、15%分離膠對(duì)得到的燕麥蛋白質(zhì)進(jìn)行SDS－PAGE電泳分析。凝膠厚度1.5 mm，燕麥蛋白上樣15μL(預(yù)先標(biāo)準(zhǔn)化為1 mg/mL)。穩(wěn)壓電泳，初始電壓80 V，樣品進(jìn)入分離膠后改為100 V，電泳3.5 h。用考馬斯亮藍(lán)R－250染色1 h，用脫色液(乙醇∶乙酸∶蒸餾水 ＝5∶2∶13)脫色 12 h。用圖像獲取和分析軟件拍照并進(jìn)行分子質(zhì)量分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次，以估計(jì)試驗(yàn)誤差。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同蛋白酶對(duì)提取率的影響

從表3可以看出，3種蛋白酶對(duì)燕麥蛋白提取率的影響大小依次為堿性蛋白酶＞中性蛋白酶＞酸性蛋白酶，且中性蛋白酶和酸性蛋白酶的提取率遠(yuǎn)低于堿性蛋白酶，這是由于中性和酸性條件下，蛋白質(zhì)溶解度低造成的。

當(dāng)堿性蛋白酶的用量小于100 U/g時(shí)，燕麥蛋白提取率隨著加酶量的增加而增加，可能是由于加酶量的增加提高了酶對(duì)不溶性蛋白的作用能力，促進(jìn)了燕麥蛋白的溶出[15]。當(dāng)加酶量超過100 U/g時(shí)，隨著加酶量的增加燕麥蛋白的提取率降低，可能是由于過多的酶將蛋白質(zhì)過度水解，空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，疏水性基團(tuán)暴露出來，使蛋白質(zhì)溶解度下降。因此，選定堿性蛋白酶為提取酶類，在加酶量為100 U/g條件下進(jìn)一步研究其他因素對(duì)燕麥蛋白提取的影響。

2.2 酶法提取燕麥蛋白單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 液料比對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響

從圖2可以看出，蛋白提取率隨液料比的增加而升高，當(dāng)液料比達(dá)18∶1時(shí)，提取率最高，可達(dá)79.71%；當(dāng)液料比超過18∶1后，提取率略有降低。這是由于液料比較小時(shí)，體系黏度較大，不利于傳質(zhì)；但液料比過大，酶與底物的接觸幾率下降，使蛋白質(zhì)的提取率降低[16]。

圖2 液料比對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響

2.2.2 pH對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響

從圖3可以看出，燕麥蛋白的提取率隨pH的增大而提高，當(dāng)pH值為11時(shí)，燕麥蛋白的提取率最大，達(dá)79.90%，之后隨著pH的增加，提取率變化不大。pH超過11時(shí)，燕麥蛋白提取液呈黃褐色，有異味，且變得黏稠，不利于下一步的分離。這可能是因?yàn)檫^高的pH使蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)之間的相互作用加強(qiáng)造成溶液黏度增加[17]，蛋白質(zhì)發(fā)生了變性。

圖3 pH值對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響

2.2.3 浸提溫度對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響

從圖4可以看出，40℃至50℃時(shí)，燕麥蛋白的提取率隨溫度的升高而增大，從50℃至55℃，提取率變化不大，僅由79.70%升高到79.99%，之后隨著溫度的升高，提取率反而降低。一方面，溫度過高時(shí)，由于熱動(dòng)能的增加導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)展開、非極性基團(tuán)暴露、聚集和沉淀作用[17]，使蛋白的溶解度降低和酶活力減弱；另一方面，溫度過高使淀粉糊化，不利于蛋白的溶出，反應(yīng)速度迅速下降。

圖4 浸提溫度對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響

2.2.4 浸提時(shí)間對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響

從圖5可以看出，20～60 min內(nèi)，蛋白質(zhì)的提取率隨著時(shí)間的延長迅速增大，其原因可能為開始時(shí)底物濃度相對(duì)較高，且淀粉的結(jié)構(gòu)隨著時(shí)間的延長而越來越松散，從而有利于酶解的傳質(zhì)過程。60 min時(shí)提取率達(dá)最大值，為79.87%；60 min后，隨時(shí)間的進(jìn)一步延長，提取率反而略有下降，原因可能是酶作用時(shí)間的延長，使蛋白質(zhì)過度水解，空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，疏水性基團(tuán)暴露出來，造成溶解度降低的緣故。

圖5 浸提時(shí)間對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響

2.3 均勻設(shè)計(jì)優(yōu)化酶法制備燕麥蛋白的工藝參數(shù)

在以上單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選定均勻試驗(yàn)設(shè)計(jì)的條件，確定因素水平表(表4)。表4顯示了均勻設(shè)計(jì)方案與結(jié)果，用直觀分析法可以看出，試驗(yàn)5的提取率最高，達(dá)83.41%，即加酶量90 U/g，pH 11.2，溫度52℃，液料比17∶1，時(shí)間45 min。但由于 pH過高，得到的燕麥蛋白提取液顏色加深，呈黃褐色，有異味，且變得黏稠，不利于下一步的分離。為得到更優(yōu)的結(jié)果，進(jìn)一步用SAS8.1對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行逐步回歸分析，建立逐步回歸的多項(xiàng)式模型。

得到回歸方程:Y＝2．339X1＋4．864X2＋28．019X3＋0．596X4－0．012 8X12－0．262X32＋0．012 4X1X4－0．001 6X4X5－854.672，校正后的決定系數(shù) R2＝0.998 7。

表4 U10(1010)均勻設(shè)計(jì)方案與結(jié)果(D＝0.428 6)

進(jìn)一步對(duì)回歸關(guān)系及各偏回歸系數(shù)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。對(duì)回歸關(guān)系進(jìn)行方差分析(表5)可知，由于F0.01(8，1)＝5 982，F(xiàn)0.05(8，1)＝238.9，故 F0.01(8，1)＞F＞F0.05(8，1)，0.05＞P＞0.01，回歸關(guān)系顯著。

表5 回歸關(guān)系的方差法分析

對(duì)各偏回歸系數(shù)進(jìn)行t檢驗(yàn)(表6)，結(jié)果表明:X1(加酶量)、X2(pH)、X3(溫度)對(duì)燕麥蛋白提取率的影響達(dá)顯著水平，X4(液料比)和X5(時(shí)間)影響不顯著。根據(jù)t檢驗(yàn)的顯著程度及偏回歸平方和的大小可判斷，各因素對(duì)指標(biāo)影響的主次順序?yàn)闇囟龋炯用噶浚緋H＞液料比＞時(shí)間。

表6 對(duì)常數(shù)項(xiàng)及偏回歸系數(shù)的t檢驗(yàn)

用規(guī)劃求解參數(shù)法[13]在試驗(yàn)空間內(nèi)找到極值點(diǎn)X1＝100．358，X2＝10．5，X3＝53．493，X4＝18，X5＝60，即加酶量 100.358 U/g，pH 10.5，溫度 53.49℃，液料比18∶1，時(shí)間60 min，在此條件下，理論提取率為83.31%。驗(yàn)證試驗(yàn)得燕麥蛋白的提取率為84.09%，與理論提取率僅差0.78%。進(jìn)一步用凱氏定氮法測(cè)得燕麥蛋白純度達(dá)89.16%，說明在此條件下提取的燕麥蛋白提取率和純度都較高。

2.4 燕麥蛋白等電點(diǎn)的確定

等電點(diǎn)沉淀是為了確保提取液中的蛋白質(zhì)能最大程度的沉淀下來。圖6所示為不同pH條件下提取液中的蛋白質(zhì)的沉淀效果。從圖6中可以看出，在pH 4.4時(shí)，燕麥蛋白的分離率最大，達(dá)93.33%，故燕麥蛋白的等電點(diǎn)為4.4。

圖6 燕麥蛋白等電點(diǎn)的確定

2.5 燕麥蛋白SDS－PAGE電泳分析

由燕麥蛋白的SDS－PAGE圖譜(圖7)可以看出，酶法制備的燕麥蛋白在65.2～12.5 ku上都有條帶分布，且主要集中在31.3～40.0 ku(條帶百分比占39.86%)，21.0～21.9 ku(條帶百分比占34.45%)2個(gè)區(qū)間，其中含量超過10%的條帶有3條，分別為:21.0 ku(條帶百分比占26.88%)，38.3 ku(條帶百分比占16.32%)，40.0 ku(條帶百分比占12.60%)，與管驍?shù)萚18]的研究結(jié)果基本一致。此外，與堿法相比，酶法制備燕麥蛋白的 58.6、53.0、42.5、29.3、28.0、25.7 ku條帶缺失，可能是因?yàn)槊笇⑵渌獾木壒省?/p>

圖7 燕麥蛋白的SDS－PAGE圖譜

3 結(jié)論

3.1 3種蛋白酶對(duì)燕麥蛋白提取率的影響大小依次為堿性蛋白酶＞中性蛋白酶＞酸性蛋白酶，選定堿性蛋白酶為提取酶類。

3.2 堿性的蛋白酶提取燕麥蛋白的最佳工藝為:加酶量100.358 U/g，pH 10.5，溫度53.49℃，液料比18∶1，時(shí)間 60 min，在此條件下，提取率為84.09%，純度達(dá)89.16%，得到的燕麥蛋白的等電點(diǎn)為4.4。

3.3 酶法制備燕麥蛋白在65.2～12.5 ku上都有條帶分布，其中74.3%的條帶集中在31.3～40.0 ku和21.0～21.9 ku2個(gè)區(qū)間，與堿法相比，有條帶缺失。

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