CDKAL1基因rs4712523多態(tài)性與內(nèi)蒙古地區(qū)漢族人群2型糖尿病相關(guān)

李曉晶，蘇 燕*，閆朝麗，顧 麗，李彩萍，李愛珍

(包頭醫(yī)學(xué)院1.生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室;2.病原生物教研室，內(nèi)蒙古包頭014060;3.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，內(nèi)蒙古呼和浩特010050)

2007年全基因組研究發(fā)現(xiàn)，細胞周期依賴性蛋白激酶5 調(diào)控相關(guān)蛋白1 樣1 (cyclin-dependent kinase 5 regulatory subunit associated protein 1-like 1，CDKAL1)基因是人類2 型糖尿病(Type 2 diabetes，T2DM)最重要的風(fēng)險基因之一。人CDKAL1基因定位于6p22.3，全長37 kb，編碼含579 個氨基酸殘基的蛋白。rs4712523 位于CDKAL1 非編碼區(qū)5 號內(nèi)含子上，研究發(fā)現(xiàn)，其單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotide polymorphism，SNP)與T2DM 發(fā)病顯著相關(guān)［1－4］。由于種族遺傳背景及生存環(huán)境的不同，在不同種族中印證已報道的疾病相關(guān)基因或位點對人類復(fù)雜性疾病發(fā)病機制的研究具有重要意義。本實驗采用等位基因特異性聚合酶鏈式反應(yīng)(AS-PCR)研究內(nèi)蒙古地區(qū)漢族人群的CDKAL1 基因rs4712523 多態(tài)性與T2DM 相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 研究對象

T2DM 組和正常對照組抗凝血取自2008年1月至2009年12月到內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科住院和體檢的內(nèi)蒙古地區(qū)無血緣關(guān)系的漢族人群。T2DM 組192 例(男98 例，女94 例，平均年齡52.5 ±9.7 歲，ΒMI 25.31 ±3.27)，對照組190 例(男101 例，女89 例，平均年齡50.5 ±7.5 歲，ΒMI 23.82 ±3.97)。T2DM 根據(jù)1999年WHO 制定的糖尿病診斷標準確診，血樣50 μL/管分裝后，－40 ℃保存?zhèn)溆?。以上研究方案符合人體試驗倫理學(xué)標準，并得到倫理委員會的批準，受試者在受試前知情同意并簽署知情同意書。

1.2 試劑

DNA 提取裂解液由包頭醫(yī)學(xué)院基因診斷研究所秦文斌教授惠贈;rs4712523 A/G PCR 引物(sense1:5'-CTTCTCCTTCTGTTGCACCCA-3'，sense2:5'-CTT CTCCTTCTGTTGCACCCG-3'，anti-sense:5'-CTGGAA GGAAAACAAAAGCA-3')由北京奧科生物科技有限公司合成;2 ×Taq Mix(北京博邁德科技發(fā)展有限公司);瓊脂糖、DL2000 DNA Marker、T 載體、DNA 凝膠回收試劑盒和質(zhì)粒小量提取試劑盒(大連寶生物工程有限公司)。

1.3 研究方法

DNA 提取按照本室常規(guī)方法進行［5］。利用等位基因特異性PCR(allele-specific polymerase chain reaction，AS-PCR)進行多態(tài)性分析，引物由北京奧科生物科技有限公司合成。PCR 反應(yīng)的總體積10 μL，其中DNA 模板1.5 μL、2 × Taq Mix 5 μL、10 μmol/L的上下游引物各0.5 μL、滅菌水2.5 μL。rs4712523 A/G 位點的PCR 反應(yīng)條件為:94 ℃預(yù)變性2 min，94 ℃變性60s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，共35 個循環(huán);72 ℃終延伸5 min。擴增產(chǎn)物直接進行1%瓊脂糖凝膠電泳，溴乙錠染色，紫外燈下觀察記錄結(jié)果并判讀基因型。每種基因型產(chǎn)物均通過切膠回收連接T 載體后，送北京博邁德科技發(fā)展有限公司進行測序。此外，抽取10%的樣本重復(fù)進行基因分型。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS13.0 統(tǒng)計學(xué)軟件。計量資料以均數(shù)±標準差(±s)表示;率的比較采用x2檢驗。通過x2檢驗判斷多態(tài)性位點的基因型頻率分布是否符合Hardy-Weinberg 平衡，計算組間各基因型頻率及等位基因頻率;Logistic 回歸分析計算OR 值及95% CI。

2 結(jié)果

2.1 臨床參數(shù)的比較及Hardy-Weinberg 平衡檢測

T2DM 組與對照組的年齡和性別之間無統(tǒng)計學(xué)意義，T2DM 組的BMI 顯著高于對照組(P＜0.05)(表1)。對T2DM 組和對照組3 種基因型的實際頻數(shù)和理論頻數(shù)進行x2檢驗，基因型頻率分布均符合Hardy-Weinberg 平衡，說明兩組樣本都具有群體代表性，能夠反映內(nèi)蒙古地區(qū)漢族人群的總體情況。

表1 T2DM 組和對照組的一般臨床指標Table 1 General clinical indices of T2DM group and control group (±s)

表1 T2DM 組和對照組的一般臨床指標Table 1 General clinical indices of T2DM group and control group (±s)

＊P＜0.05 compared with control group．

groupsex(male/female) age (year)BMI(kg/m2)control101/8950.5 ±7.523.82 ±3.97 T2DM98/9452.5 ±9.725.31 ±3.46*

2.2 CDKAL1 基因rs4712523 SNP 基因型和等位基因頻率分布

CDKAL1 基因rs4712523 位點PCR 擴增產(chǎn)物長度為169 bp，與測序結(jié)果吻合，分別可以得到AA、AG 和GG 3 種基因型。T2DM 組與正常對照組rs4712523 位點均以AG 基因型為主，3 種基因型在兩組間的分布有顯著性差異(x2= 25.666，P＜0.001)，其中T2DM 組的GG 和AG 基因型頻率(6.3%，82.3%)均高于正常對照組(3.2%，64.2%)。此外，T2DM 組G 等位基因頻率增高，A等位基因頻率降低，A 和G 等位基因頻率在兩組間分布有顯著性差異(x2=11.592，P＜0.05)，G 等位基因攜帶者患T2DM 的風(fēng)險是A 等位基因的1.654倍(OR=1.654，95% CI=1.237－2.212)(表2)。

表2 T2DM 組與對照組組CDKAL1 基因rs4712523位點基因型分布和等位基因頻率Table 2 The genotype distribution and allele frequency of rs4712523 in CDKAL1 gene of T2DM and control group

3 討論

CDK5 是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在胰腺組織中通過形成CDK5/P35 復(fù)合物被激活，從而抑制胰島素的分泌作用［6］，特別是在高血糖條件下CDK5 的過度活化使胰島素釋放率下降，降低胰島素的產(chǎn)生和減少胰島素基因表達［7］。研究發(fā)現(xiàn)CDKAL1在人類胰腺、骨骼肌細胞及腦組織中高度表達，其蛋白能夠特異地抑制CDK5 的活化［6－8］。也有報道認為CDKAL1 可以通過促進ATP 的生成，而控制β 細胞內(nèi)第一階段胰島素的釋放［9］。因此，CDKAL1 基因突變可能導(dǎo)致對CDK5 抑制作用的喪失，進而增加罹患T2DM 的風(fēng)險。本研究對內(nèi)蒙古地區(qū)漢族人群382 例血液樣本進行檢測，入選本實驗的兩組人群在性別和年齡上均互相匹配，用AS-PCR對rs4712523 A/G 基因進行基因分型，操作簡便、經(jīng)濟、重復(fù)性好。結(jié)果表明，CDKAL1 基因rs4712523 位點的3 種基因型在T2DM 組與對照組中的分布差異有統(tǒng)計學(xué)意義，G 等位基因攜帶者患T2DM 的風(fēng)險是A 等位基因的1.654 倍。以上結(jié)果說明，CDKAL1 基因rs4712523 多態(tài)性與內(nèi)蒙古地區(qū)漢族人T2DM 的發(fā)病具有顯著相關(guān)性，G 等位基因是T2DM 的風(fēng)險等位基因。本研究結(jié)果與目前相關(guān)文獻報道的歐洲、亞洲人群［10－11］結(jié)果基本一致。但CDKAL1 基因如何引起胰島素分泌改變的機制尚不清楚，有待通過進一步研究來闡明。

［1］Roo H，Woo J，Kim Y，et al．Heterogeneity of genetic associations of CDKAL1and HHEX with susceptibility of type 2 diabetesmellitus by gender［J］．Eur J Hum Genet，2011，19:672－675．

［2］Zhao J，Li M，Βradfield J，et al．Examination of type 2 diabetes loci implicates CDKAL1 as a birth weight gene［J］．Diabetes，2009，58:2414－2418．

［3］Steinthorsdottir V，Thorleifsson G，Reynisdottir I，et al．A variant in CDKAL1 influences insulin response and risk of type 2 diabetes［J］．Nat Genet，2007，39:770－775．

［4］Kirchhoff K，Machicao F，Haupt A，et al．Polymorphisms in the TCF7L2，CDKAL1 and SLC30A8 genes are associated with impaired proinsulin conversion［J］．Diabetologia，2008，51:597－601．

［5］韓麗紅，王彩麗，閆斌，等．PAI-1 基因4G/5G 多態(tài)性與內(nèi)蒙地區(qū)IgA 腎病的相關(guān)性研究［J］．放射免疫學(xué)雜志，2009，22:74－76．

［6］Ching YP，Pang AS，Lam WH，et al．Identification of a neuronal Cdk5 activator-binding protein as Cdk5 inhibitor［J］．J Βiol Chem，2002，277:15237－15240．

［7］Ubeda M，Rukstalis JM，Habener JF，et al．Inhiβition of cyclin-dependent kinase 5 activity protects pancreatic cells from glucotoxity［J］．J Βiol Chem，2006，281:28858－28864．

［8］Wei FY，Naqashima K，Ohshima T，et al．Cdk5-dependent regulation of glucose-stimulated insulin secretion［J］．Nat Med，2005，11:1104-1108．

［9］Mica OI，Masashi Y，Kyota A，et al．Deletion of CDKAL1 Affects Mitochondrial ATP Generation and First-Phase Insulin Exocytosis［J］．PLoS ONE，2010，5:1－11．doi:10．1371/journal．pone．0015553．

［10］Scott LJ，Mohlke KL，Βonnycastle LL，et al．A genomewide association study of type 2 diabetes in Finns detects multiple susceptibility variants［J］．Science，2007，316:1341－1345．

［11］Takeuchi F，Serizawa M，Yamamoto K，et al．Confirmation of multiple risk Loci and genetic impacts by a genomewide association study of type 2 diabetes in the Japanese population［J］．Diabetes，2009，58:1690－1699．