HSD1蛋白在精子發(fā)生過程中的空間特異性表達(dá)

宋 偉，陳迎春，繆時英，王琳芳

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)國家重點實驗室生物化學(xué)與分子生物學(xué)系，北京100005)

蛋白質(zhì)在細(xì)胞中的定位與其功能之間存在密切關(guān)系。越來越多的研究證據(jù)顯示，很多蛋白質(zhì)在細(xì)胞中的空間分布呈動態(tài)變化，如在細(xì)胞周期的不同時相或細(xì)胞發(fā)育的不同階段等。在這些情況下，蛋白質(zhì)將根據(jù)細(xì)胞的生理需要定位于不同的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，從而發(fā)揮特定功能。因此，探討蛋白質(zhì)在時間和空間上的特異表達(dá)變化有助于我們了解其功能。精子發(fā)生過程中存在許多空間與時間特異性表達(dá)基因，它們在生精細(xì)胞分化成熟為精子的過程中發(fā)揮著重要作用［1－3］。最近研究發(fā)現(xiàn)一些蛋白質(zhì)在生精細(xì)胞分化的不同階段定位于不同的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，進(jìn)而發(fā)揮不同作用調(diào)節(jié)精子的分化與成熟［4－6］。因此，研究這些具有空間分布動態(tài)變化的蛋白質(zhì)功能對闡明精子發(fā)生的分子機制具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

SPF 級雄性ICR 小鼠體質(zhì)量25 ±5 g中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物研究所(合格證號:0202589)。CHO 細(xì)胞系(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞中心提供)。HSD1 兔多克隆抗體(王琳芳教授實驗室制備)。免疫熒光檢測試劑盒(中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。pEGFP-C1 真核表達(dá)載體(王琳芳教授實驗室保存)。

1.2 方法

1.2.1 載體構(gòu)建:從睪丸cDNA 文庫中擴增HSD1全長片段，與pEGFP-N1 載體進(jìn)行相同雙酶切，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳切膠回收后進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化，最終篩選陽性克隆并送測序。測序正確的克隆用于轉(zhuǎn)染實驗。

1.2.1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染:轉(zhuǎn)染前1 天消化并接種CHO 細(xì)胞至12 孔板，使第2 天轉(zhuǎn)染時細(xì)胞匯合度為60% ～80%。使用LIPOFECTAMINETM2000 進(jìn)行轉(zhuǎn)染，具體步驟按說明書操作。

1.2.3 生精細(xì)胞的分離:各期生精細(xì)胞的分離采用改良重力沉降法。分離ICR 小鼠曲細(xì)精管，通過膠原蛋白酶、胰蛋白酶和DNase Ⅰ進(jìn)行33 ℃溫育消化，制成單細(xì)胞懸液并進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)。制備2% ～4%的牛血清白蛋白連續(xù)梯度溶液，加入單細(xì)胞懸液，4 ℃沉降3 h。分別收集細(xì)胞溶液組分，并接種到無菌培養(yǎng)瓶中，37 ℃培養(yǎng)6 ～8 h。輕搖培養(yǎng)瓶使精原細(xì)胞懸浮并吸出培養(yǎng)液，光鏡下檢測細(xì)胞純度和數(shù)量，并計算均值。

1.2.4 成熟精子的分離:12 周齡的雄性小鼠斷頸處死后取附睪，置于PBS 溶液中。將附睪剪碎，移入離心管中，4 ℃靜置2 h。小心吸出上清，光鏡下觀察到活動精子。3 500 r/min離心15 min，收集成熟精子。

1.2.5 細(xì)胞免疫熒光檢測:免疫熒光檢測試劑盒(英駿公司)，具體步驟按說明書操作。

1.2.6 免疫電鏡檢測:固定液4 ℃固定細(xì)胞2 h。冰預(yù)冷乙醇進(jìn)行梯度脫水，K4M 低溫包埋劑浸泡去除乙醇。包埋和聚合樣品，制備免疫電鏡超薄切片。進(jìn)行電鏡金標(biāo)免疫反應(yīng)，電鏡觀察結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 HSD1 蛋白在小鼠生精細(xì)胞中呈空間特異性表達(dá)分布

HSD1 蛋白從精母細(xì)胞期開始表達(dá)，并且主要表達(dá)于初級精母細(xì)胞和圓形精子細(xì)胞的胞質(zhì)中;而在發(fā)育成熟的精子細(xì)胞，HSD1 蛋白主要表達(dá)于頂體和尾部(圖1)。

2.2 HSD1 蛋白在CHO 細(xì)胞中呈空間型表達(dá)分布

成功構(gòu)建HSD1 和綠色熒光蛋白融合表達(dá)的載體質(zhì)粒pEGFP-C1-HSD1。將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染處于生長對數(shù)期的CHO 細(xì)胞24 h后，HSD1 蛋白在該細(xì)胞系中主要有3 種分布形式:1)主要分布在胞核中，在總數(shù)為227 個轉(zhuǎn)染細(xì)胞中，16%(36 個)細(xì)胞中融合蛋白主要分布在胞核中;2)在胞質(zhì)和胞核中均有分布，54%(124 個)細(xì)胞中融合蛋白分布在胞質(zhì)和核中;3)主要分布在胞質(zhì)中30%(67 個)細(xì)胞中融合蛋白主要定位在胞質(zhì)中(圖2)。

2.3 HSD1 蛋白具有細(xì)胞質(zhì)-細(xì)胞核的穿梭特性

2.3.1 出核轉(zhuǎn)運抑制劑細(xì)霉素B 抑制HSD1 蛋白在CHO 細(xì)胞中的轉(zhuǎn)運出核:出核抑制劑Leptomycin B (LMB)處理CHO 細(xì)胞后大部分HSD1-GFP 融合蛋白分布在胞核中(圖3A)。在總數(shù)為229 個轉(zhuǎn)染細(xì)胞中，63%(143 個)細(xì)胞中融合蛋白存在于胞核中;29%(67 個)細(xì)胞中融合蛋白分布在胞質(zhì)和核中;8%(19 個)細(xì)胞中融合蛋白分布在胞質(zhì)中(圖3B)。由此初步判定HSD1 蛋白在細(xì)胞中呈動態(tài)分布，存在細(xì)胞核-質(zhì)間的穿梭運動。

2.3.2 HSD1 蛋白通過核孔復(fù)合體轉(zhuǎn)運出核:免疫電鏡結(jié)果顯示，HSD1 蛋白在胞質(zhì)和胞核中均有分布(圖3C)。同時在核孔面向胞核一側(cè)發(fā)現(xiàn)一串陽性金顆粒，表明HSD1 蛋白正在通過核孔復(fù)合體，從而有力的說明該蛋白在細(xì)胞中具有細(xì)胞核-質(zhì)穿梭行為(圖3C)。

3 討論

HSD1 基因是王琳芳教授實驗室利用不孕婦女患者的血清篩選人睪丸λgt11 cDNA 表達(dá)型文庫而獲得的一個新基因，其GenBank 注冊號為U12978。該基因編碼一個由523 個氨基酸組成的睪丸高表達(dá)蛋白質(zhì)。該實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)，HSD1 與微管蛋白結(jié)合并調(diào)節(jié)其裝配［7］;HSD1 蛋白參與調(diào)節(jié)細(xì)胞G2/M 期進(jìn)程［8］;HSD1 蛋白與ACT 結(jié)合調(diào)節(jié)精子發(fā)生過程中CREM-ACT 介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄［9］。由此推測，HSD1 在精子發(fā)生過程中是一個多功能蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位與其功能關(guān)系密切［10－11］，因此觀察HSD1 蛋白在生精細(xì)胞中的空間特異性分布情況。免疫熒光實驗結(jié)果顯示，HSD1 蛋白在初級精母細(xì)胞和圓形精子細(xì)胞的胞質(zhì)中表達(dá)，而在成熟精子細(xì)胞中主要表達(dá)于頂體和尾部。為進(jìn)一步研究該蛋白的亞細(xì)胞定位，外源表達(dá)pEGFP-C1-HSD1融合蛋白觀察其在CHO 細(xì)胞中的動態(tài)分布情況。研究結(jié)果表明該蛋白在CHO 細(xì)胞中存在3 種分布形式:細(xì)胞核型、細(xì)胞質(zhì)型和核質(zhì)分布型。根據(jù)這種分布特點推測，HSD1 蛋白具有核質(zhì)穿梭能力。使用特異性出核抑制劑LMB 后，HSD1-GFP 融合蛋白大部分滯留于CHO 細(xì)胞核中，由此判定該蛋白在細(xì)胞中存在細(xì)胞核-質(zhì)間的穿梭運動。這一結(jié)論進(jìn)一步被免疫電鏡結(jié)果所證實，觀察到正在通過核孔復(fù)合體的金顆粒標(biāo)記的HSD1 蛋白，從而更有力的說明該蛋白在細(xì)胞中具有細(xì)胞核-質(zhì)穿梭行為。上述研究結(jié)果為進(jìn)一步探索HSD1 蛋白在精子發(fā)生過程中的分子機制提供了重要依據(jù)。

圖3 出核轉(zhuǎn)運抑制劑細(xì)霉素B 處理CHO 細(xì)胞后HSD1 的定位檢測Fig 3 The localization of HSD1 in CHO cells after treating with nuclear transport inhibitor LMB by immunofluorescence(×400)and immune electron microscopy (×30 000)

［1］Fu J，Wang Y，F(xiàn)ok KL，et al．Anti-ACTL7a antibodies:a cause of infertility［J］．Fertil Steril，2012，97:1226－1233．

［2］Wang Y，Zhang N，Zhang X，et al．Experimental immunological infertility effect of anti-GAPDH-2 antibodies on the fertility of female mice［J］．Fertil Steril，2009，92:2020－2027．

［3］Li S，Qiao Y，Di Q，et al．Interaction of SH3P13 and DYDC1 protein:a germ cell component that regulates acrosome biogenesis during spermiogenesis［J］．Eur J Cell Biol，2009，88:509－520．

［4］Sasaki K，Suzuki A，Kagatsume S，et al．Acetylation of Prrp K150 regulates the subcellular localization［J］．Gene，2012，491:13－19．

［5］Lin YT，Yen PH．A novel nucleocytoplasmic shuttling sequence of DAZAP1，a testis-abundant RNA-binding protein［J］．RNA，2006，12:1486－1493．

［6］Cho YS，Chennathukuzhi VM，Handel MA，et al．The relative levels of translin-associated factor X (TRAX)and testis brain RNA-binding protein determine their nucleocytoplasmic distribution in male germ cells［J］．J Biol Chem，2004，279:31514－31523．

［7］Tang X，Zhang J，Cai Y，et al．Sperm membrane protein(hSMP-1)and RanBPM complex in the microtubule-organizing centre［J］．J Mol Med (Berl)，2004，82:383－388．

［8］Li R，Tang XL，Miao SY，et al．Regulation of the G2/M phase of the cell cycle by sperm associated antigen 8(SPAG8)protein［J］．Cell Biochem Funct，2009，27:264－268．

［9］Wu H，Chen Y，Miao S，et al．Sperm associated antigen 8(SPAG8)，a novel regulator of activator of CREM in testis during spermatogenesis［J］．FEBS Lett，2010，584:2807－2815．

［10］Cmielova J，Rezacova M．P21Cip1/Waf1 protein and its function based on a subcellular localization［J］．J Cell Biochem，2011，112:3502－3506．

［11］Thomsen C，Udhane S，Runnberg R，et al．Fused in sarcoma (FUS)interacts with the cytolinker protein plectin:implications for FUS subcellular localization and function［J］．Exp Cell Res，2012，318:653－661．