當(dāng)歸多糖對(duì)小鼠衰老造血干細(xì)胞細(xì)胞周期蛋白的調(diào)控

張先平，王乾興，陳 斌，劉 俊，魏 強(qiáng)，王建偉，王亞平*

(1.重慶醫(yī)科大學(xué)組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室干細(xì)胞與組織工程研究室，重慶400016;2.遵義醫(yī)學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)教研室，貴州遵義563003;3.山東省棗莊市臺(tái)兒莊區(qū)中醫(yī)院急診科，山東棗莊277400)

細(xì)胞衰老是指細(xì)胞在信號(hào)傳導(dǎo)作用下不可逆地脫離細(xì)胞周期并喪失增殖能力后進(jìn)入的一種相對(duì)穩(wěn)定的狀態(tài)，表現(xiàn)為永久性細(xì)胞周期停滯。造血干細(xì)胞(hematopoietic stem cell，HSC)的功能受細(xì)胞周期調(diào)控，由細(xì)胞的內(nèi)源性調(diào)控及細(xì)胞的外在因素相互作用完成［1－2］。細(xì)胞周期的內(nèi)源性調(diào)控受細(xì)胞周期蛋白(Cyclin)-細(xì)胞周期蛋白依賴激酶(CDK)-細(xì)胞周期蛋白依賴激酶抑制蛋白(CKI)共同調(diào)節(jié)，CDK是細(xì)胞周期調(diào)控的核心，CKI 是負(fù)性調(diào)節(jié)因子，而Cyclin 則是正性調(diào)節(jié)因子，CDK2 及CDK6 屬于CDK家族成員，P16 與P21 則是CKI 家族。當(dāng)歸多糖(angelica sinensis polysaccharide，ASP)是從當(dāng)歸中分離、提取的藥用有效成分，具有促進(jìn)造血、抗輻射損傷、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)等作用［3－5］。目前，有關(guān)ASP 能否延緩HSC 衰老及其作用機(jī)制尚不清楚。本研究通過觀察ASP 對(duì)X 線誘導(dǎo)HSC 衰老過程中細(xì)胞周期調(diào)控蛋白P16、P21、CDK2、CDK6、CyclinD及CyclinE 表達(dá)的影響，旨在闡明ASP 延緩HSC 衰老的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物和主要試劑

清潔級(jí)C57BL/6J 小鼠，雌雄各半，6 ～8 周齡，體質(zhì)量16 ～20 g，由重慶醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供［合格證號(hào):SCXK(渝)2007-0001］。當(dāng)歸多糖(Angelica sinensis polysaccharide，ASP)(陜西慈緣生物技術(shù)有限公司)，純度≥95%;Anti-Sca-1 MicroBead Kit(Miltenyi 公司);SA-β-Gal Staining Kit(Cell Signaling 公司);甲基纖維素半固體培養(yǎng)基(MethoCult GF M3434)(StemCell Technologies 公司);P16、P21、CDK2、CDK6 及CyclinD 兔抗鼠多克隆抗體(Bioworld Technology 公司);抗GAPDH 小鼠單克隆抗體及辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗小鼠抗體(Jackson 公司)。

1.2 動(dòng)物分組及處理

96 只小鼠隨機(jī)均分為對(duì)照組、衰老組、ASP 干預(yù)對(duì)照組和ASP 干預(yù)衰老組。ASP 干預(yù)衰老組和衰老組小鼠采用X 線3.0 Gy全身均勻照射(照射能量6 MeV，時(shí)間1 min，高度100cm，面積為25 cm ×25 cm)每10 天1 次，共8 次，總計(jì)24 Gy(3.0 Gy/8F)，并于照射當(dāng)日分別給予ASP 200 mg/kg和等容量NS 灌胃，隔天1 次，共40 次［6－7］。對(duì)照組和ASP干預(yù)對(duì)照組分別給予等容量NS 和ASP 灌胃。末次照射后第10 天處死動(dòng)物。

1.3 HSC 分離與鑒定

脫頸處死小鼠，取出股骨及脛骨，用RPMI 1640培養(yǎng)液沖出骨髓，制備單細(xì)胞懸液，加淋巴細(xì)胞分離液分離骨髓單個(gè)核細(xì)胞(marrow mononuclear cell，MNC)。采用HSC 最常見標(biāo)志物Sca-1 鑒定及分選干細(xì)胞［8］，流式細(xì)胞術(shù)及混合集落培養(yǎng)以鑒定HSC。

1.4 SA-β-Gal 染色

取1 ×105個(gè)HSC，PBS 洗滌2 次，按試劑盒說明書操作。甘油封片鏡檢，以隨機(jī)計(jì)數(shù)的400 個(gè)細(xì)胞中陽性細(xì)胞的個(gè)數(shù)計(jì)算陽性細(xì)胞率［9］。

1.5 HSC 混合集落培養(yǎng)

收集各組1 ×104個(gè)HSC，加MethoCult 1 mL充分混勻，接種于96 孔板，在5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中孵育10 ～12 d，依接種HSC 數(shù)量與混合集落形成單位(colony forming unity-mixture，CFU-Mix)的數(shù)量評(píng)價(jià)各組細(xì)胞的多向分化能力。

1.6 流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期

各組收集1 ×105個(gè)HSC，PBS 洗滌，70% 冰乙醇固定過夜。離心棄上清，PBS 洗滌，100 μL牛胰核糖核酸酶，37 ℃孵育30 min。碘化丙啶(50 mg/L)避光反應(yīng)30 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)，Multicycle 軟件分析。

1.7 Western blot 檢測(cè)P16、P21、CDK2、CDK6、CyclinD 及CyclinE 蛋白表達(dá)

細(xì)胞總蛋白用BCA 法測(cè)定濃度，SDS-PAGE 電泳分離。一抗(濃度1∶500)4 ℃過夜，二抗37 ℃1 h，ECL 發(fā)光。Quantity-One 軟件分析，目的蛋白表達(dá)量用目的條帶與GAPDH 條帶的吸光度的比值表示。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 HSC 分離與鑒定

分離純化后Sca-1+細(xì)胞純度為(86.21 ±6.17)%，顯著高于分選前MNC 中Sca-1+細(xì)胞百分比(11.45 ±1.87)%?；旌霞渑囵B(yǎng)顯示，Sca-1+細(xì)胞具有混合集落形成的特性，而Sca-1－細(xì)胞無混合集落形成。

2.2 SA-β-Gal 染色

SA-β-Gal 染色顯示陽性細(xì)胞體積增大，胞質(zhì)呈藍(lán)色，陰性細(xì)胞未著色(圖1)。對(duì)照組和ASP 干預(yù)對(duì)照組HSC SA-β-Gal 陽性率分別為(9.88 ±0.97)和(9.91 ±1.08)%;衰老組HSC SA-β-Gal 陽性率為(54.14 ±5.58)%，顯著高于對(duì)照組(P＜0.01);與衰老組比較，ASP 干預(yù)衰老組SA-β-Gal 陽性率為(11.42 ±1.07)%，ASP 能顯著抑制衰老HSC SAβ-Gal 陽性率的增加(P＜0.01)(圖1)。

2.3 CFU-Mix 的形成能力

在104個(gè)HSC 中，對(duì)照組和ASP 干預(yù)對(duì)照組HSC 形成的CFU-Mix 數(shù)量分別為(21.25 ±2.29)和(20.25 ±2.05)個(gè)，衰老組CFU-Mix 數(shù)量為(8.63 ±1.19)個(gè)，顯著低于對(duì)照組(P＜0.01);與衰老組比較，ASP 干預(yù)衰老組HSC 形成的CFU-Mix 數(shù)量為(19.25 ±1.76)個(gè)，ASP 能明顯抑制衰老HSC CFUMix 數(shù)量的減少(P＜0.01)(圖2)。

2.4 細(xì)胞周期分布

與對(duì)照組比較，衰老組HSCG0/G1期比例顯著增加、S 期比例顯著減少(P＜0.01)。與衰老組比較，ASP 能顯著抑制衰老HSC G1期比例的增加及S期比例的減少(P＜0.01)(表1，圖3)。

2.5 細(xì)胞周期調(diào)控基因蛋白表達(dá)

與對(duì)照組比較，衰老組HSC P16、P21 蛋白表達(dá)顯著增加(P＜0.01)，CDK6、Cyclin D 及CyclinE 蛋白表達(dá)顯著降低(P＜0.01)。與衰老組比較，ASP 能顯著下調(diào)HSC P16 和P21 蛋白的表達(dá);明顯上調(diào)CDK6、CyclinD 及CyclinE 蛋白的表達(dá)(P＜0.01)(圖4)。

3 討論

機(jī)體在衰老過程中造血系統(tǒng)的基本成分雖然得以維持，但HSC 的功能和數(shù)量卻逐漸降低，導(dǎo)致機(jī)體免疫功能和全身組織器官功能的衰退等［8，10－11］。研究表明，6.5 Gy γ 射線全身均勻照射C57 小鼠可選擇性地誘導(dǎo)HSC 衰老［12］。本研究發(fā)現(xiàn)，衰老組HSC SA-β-Gal 染色陽性率顯著增加而混合集落形成能力明顯降低，提示經(jīng)X 線照射的小鼠HSC 具有典型的衰老生物學(xué)特征，證實(shí)3.0 Gy/8F 的X 線能誘導(dǎo)小鼠HSC 衰老。

表1 HSCs 細(xì)胞周期比例Table 1 The ratio of cell cycle of HSC(±s，n=8)

表1 HSCs 細(xì)胞周期比例Table 1 The ratio of cell cycle of HSC(±s，n=8)

*P＜0.01 compared with control group;#P＜0.01 compared with aging group．

groupG0/G1 phase(%)G2/M phase(%)S phase(%)ASP regulatiom control group70.40 ±3.21#7.59 ±1.37#21.76 ±3.67#control group68.90 ±4.29#8.09 ±1.61#23.18 ±3.90#aging group86.29 ±2.54*3.34 ±1.07*9.49 ±2.42*ASP regulation aging group72.48 ±4.71#6.80 ±2.35#20.72 ±3.11#

細(xì)胞衰老是一種復(fù)雜的、多因素及細(xì)胞周期調(diào)控下多基因參與的過程。在此過程中，HSC 精確的細(xì)胞周期調(diào)控也伴隨著細(xì)胞衰老發(fā)生改變。本研究發(fā)現(xiàn)，3.0 Gy/8F X 線能促進(jìn)小鼠HSC 停滯于G1期而不進(jìn)入S 期，從而誘發(fā)細(xì)胞衰老的特征性改變。研究表明［13］細(xì)胞周期G1期的關(guān)卡是細(xì)胞衰老的關(guān)鍵調(diào)控點(diǎn)，P16 在該調(diào)控點(diǎn)發(fā)揮重要作用，能特異地與CDK6 結(jié)合，阻止CyclinD/CDK6 的形成，使Rb蛋白低磷酸化，導(dǎo)致細(xì)胞不可逆地停滯于G1期，以維持細(xì)胞衰老的特征性改變。清除P16 陽性衰老細(xì)胞可以延緩脂肪組織、骨骼肌肉和眼等年齡相關(guān)疾病的進(jìn)展延緩衰老［14］。P21 為CDK 的廣泛抑制物，可通過抑制CDK2/CyclinE 及CDK6/CyclinD 等的活性使Rb 低磷酸化，阻止G1期向S 期轉(zhuǎn)變［15］。本研究顯示，衰老組小鼠P16、P21 蛋白表達(dá)增加而CDK6、CyclinD、CyclinE 蛋白表達(dá)降低，提示3.0 Gy/8F 的X 線照射可能通過上調(diào)這兩種CKI 的表達(dá)而誘導(dǎo)HSC 的G1期阻滯從而誘導(dǎo)HSC 衰老。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，ASP 能顯著抑制衰老HSC SA-β-Gal 染色陽性率的增加、CRU-Mix 數(shù)量的減少、G1期比例的增加及S 期比例的減少;同時(shí)下調(diào)P16、P21蛋白表達(dá);上調(diào)CDK6、CyclinD、CyclinE 蛋白表達(dá)。由此推測(cè)，ASP 可能通過降低P16 和P21 蛋白的表達(dá)，從而增加CyclinD/CDK6、CDK2/CyclinE 的形成，使Rb 蛋白磷酸化，轉(zhuǎn)錄因子E2F 被釋放出來，從而細(xì)胞由G1期進(jìn)入S 期，解除了X 線對(duì)HSC 的增殖和分化抑制效應(yīng)，即增加其自我更新與多向分化能力以延緩HSC 的衰老。至于本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)ASP 對(duì)小鼠衰老HSC CDK2 蛋白表達(dá)無明顯影響，有待于進(jìn)一步研究。

綜上所述，ASP 可延緩X 線誘導(dǎo)的小鼠HSC 衰老，其機(jī)制可能與細(xì)胞周期調(diào)控基因的表達(dá)有關(guān)，為探索延緩干細(xì)胞衰老及老年相關(guān)性疾病的有效藥物奠定理論基礎(chǔ)。

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