紫露草花色形成的機(jī)理分析

李慧波，劉雅莉，岳 娟，婁 倩

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)林學(xué)院，陜西 楊凌 712100； 2.西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

藍(lán)紫色花具有較高的科研、觀賞和文化價(jià)值[1-2]，目前關(guān)于藍(lán)紫色花著色的機(jī)理主要有以下3種：第1，液泡pH值理論，該理論認(rèn)為花色變化依賴于pH值，花青素在強(qiáng)酸條件下顯紅色，中性或堿性條件下趨于藍(lán)紫色[3]；第2，金屬螯合理論，認(rèn)為某些金屬離子會(huì)與花青素結(jié)合形成高度著色且穩(wěn)定的絡(luò)合物，可以使一些花色趨于藍(lán)紫色[4]；第3，分子結(jié)合理論，認(rèn)為一些植物的色素分子之間彼此相互結(jié)合或堆疊，自身合成超分子色素，最終發(fā)展成藍(lán)紫色[5]。此外，藍(lán)紫色花的形成還受到花瓣表皮細(xì)胞形狀[6]、色素空間分布及花發(fā)育階段等多種因素的影響[7]。

紫露草(Tradescantiaalbiflora)是單子葉植物鴨跖草科(Commelinaceae)多年生草本植物，因其具有較純正的藍(lán)紫色花，且花期長(zhǎng)、著花繁密，常被用作地被植物。本研究以具有藍(lán)紫色花的紫露草為對(duì)象，通過綜合分析花瓣表皮細(xì)胞形狀、色素分布、金屬元素種類含量及花色素成分，對(duì)紫露草花色形成的主要影響因素進(jìn)行分析，以期為藍(lán)紫色花花色形成機(jī)理的研究及花色育種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1植物材料 紫露草新鮮花瓣于2012年5月上旬09:00采自陜西楊凌西北農(nóng)林科技大學(xué)南校區(qū)。選取生長(zhǎng)環(huán)境相同、長(zhǎng)勢(shì)一致且花蕾數(shù)多的植株，采集盛花期的花瓣，一部分迅速帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行測(cè)色、花瓣解剖學(xué)分析、原生質(zhì)體提取及金屬元素分析的樣品制備；另一部分于-80 ℃冰箱中保存，用于花青素苷、黃酮醇苷的提取分析。

1.1.2儀器設(shè)備 花瓣顏色采用英國(guó)皇家園藝學(xué)會(huì)比色卡RHSCC(Royal Horticultural Society Colour Chart)和色差儀CR-400(Konica Minolta Investment Ltd.,China)完成測(cè)定；花瓣解剖結(jié)構(gòu)分析使用顯微鏡Eclipse 50i(Nikon,Japan)進(jìn)行觀察；用于花瓣表皮細(xì)胞形狀掃描電鏡觀察的樣品采用EMITECH K850 CO2臨界點(diǎn)干燥儀干燥，JEOLLFC-1600 Auto Fine Coater離子濺射儀鍍金，JOEL掃描電子顯微鏡照相儀拍照；金屬元素分析通過CEM Mars 微波消解儀(CEM，USA)，820-MS電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(Varian，USA)確定；用于花色素測(cè)定的花瓣樣品使用北京四環(huán)LGJ-10D冷凍機(jī)干燥，花色素成分分析采用日立L-2000系列高效液相色譜-二極管陣列檢測(cè)器聯(lián)用(HPLC-DAD，HITACHI公司)完成；微量元素標(biāo)準(zhǔn)品(Mg,Al,Ca,Fe,Zn,Cu,Mn,Cd)購(gòu)自國(guó)家有色金屬及電子材料分析測(cè)試中心。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1紫露草花瓣顏色的測(cè)定 RHSCC比色?；ǘ洳杉笱杆賻Щ貙?shí)驗(yàn)室，選取新鮮花瓣，在室內(nèi)散射光條件下(避免日光直射)將花瓣中間部分與英國(guó)皇家園藝學(xué)會(huì)比色卡(RHSCC)進(jìn)行對(duì)比。

色差儀測(cè)色。選取紫露草5個(gè)不同的單株，每株選擇1個(gè)花瓣，將花瓣的中間部分對(duì)準(zhǔn)色差儀的集光孔進(jìn)行測(cè)量，計(jì)算其平均值。

1.2.2紫露草花瓣解剖結(jié)構(gòu)和細(xì)胞特性的觀察 紫露草花瓣橫切面的觀察。選取盛花期的紫露草新鮮花瓣，用刀片在花瓣中部切取長(zhǎng)約10 mm，寬0.5～1.0 mm的片段，用鑷子置于載玻片上，再用刀片縱切2～3次，得到較薄的橫切面，置于顯微鏡下觀察。

紫露草花瓣表皮細(xì)胞的觀察。選取盛花期的紫露草新鮮花瓣，用刀片切取花瓣表皮約0.5 mm片段，置于顯微鏡下觀察。

紫露草花瓣表皮細(xì)胞形狀掃描電鏡的觀察。采用CO2臨界干燥法制備掃描電鏡樣品?；ò瓴杉笙群笸ㄟ^2.5%戊二醛緩沖液浸泡2 h、0.1 mol·L-1磷酸緩沖液漂洗3次(15 min·次-1)、乙醇梯度脫水(30%-50%-70%-80%-90%-100%)15 min·次-1、乙酸異戊酯置換15 min·次-1，最后用EMITECH K850 CO2臨界點(diǎn)干燥儀干燥，JEOLLFC-1600 Auto Fine Coater離子濺射儀鍍金，JOEL掃描電子顯微鏡照相儀觀察花瓣表皮細(xì)胞形狀。

紫露草花瓣原生質(zhì)體的制備。選取盛花期新鮮花瓣1 g橫向切割成寬為2～3 mm的條帶，置于10 mL酶解液(0.2 g纖維素酶，0.02 g離析酶，0.6 mol·L-1甘露醇，20 mmol·L-1MES-Tris，pH值5.8)中。放入真空旋轉(zhuǎn)干燥儀中抽真空10 min，23 ℃黑暗條件下靜止1～2 h進(jìn)行酶解。酶解后取出，輕輕搖晃數(shù)下，加入適量洗液，輕搖，過0.1 mm篩，4 ℃ 882 r·min-1離心2 min，用寬口槍頭吸出上清，可見原生質(zhì)體沉淀于底部，輕輕搖晃使原生質(zhì)體懸浮。

1.2.3紫露草花瓣中金屬元素含量的測(cè)定 樣品預(yù)處理。收集盛花期的紫露草新鮮花瓣(20 g)置于培養(yǎng)皿中，用雙蒸水反復(fù)沖洗干凈。沖洗后的花瓣置于烘箱中105 ℃殺青30 min后，80 ℃干燥至質(zhì)量恒定。

金屬元素分析。干燥后的樣品在研缽中研細(xì)成粉末狀，準(zhǔn)確稱取0.600 g，加入5 mL濃硝酸及1 mL雙氧水，通過CEM Mars 微波消解儀消解。微波消解程序：1 200 W，120 ℃保持5 min；1 200 W，160 ℃保持10 min；1 200 W，180 ℃保持20 min。消解后的樣品通過Varian 820-MS 電感耦合等離子體質(zhì)譜儀，進(jìn)行金屬元素Mg、Al、Ca、Fe、Zn、Cu、Mn和Cd含量測(cè)定。功率1 400 W，等離子氣流量18 L·min-1，載氣流量1.80 L·min-1，采樣深度7.5 mm，信號(hào)采集模式為跳峰。

1.2.4紫露草花瓣中花青素苷和黃酮醇苷種類及含量的測(cè)定 提取方法:于-80 ℃ 6 236 r·min-1冰箱中保存的紫露草花瓣通過LGJ-10D冷凍干燥機(jī)冷凍干燥36 h后研磨充分，稱取0.05 g粉末2份，分別加入2 mL 3% HCL的甲醇和2 mL 100%甲醇中，置于4 ℃冰箱中避光浸提24 h，4 ℃ 5 000×g離心5 min，分離上清液，供花青素苷和黃酮醇苷定量分析。利用日立L-2000系列高效液相色譜-二極管陣列檢測(cè)器聯(lián)用(HPLC-DAD，HITACHI公司)進(jìn)行花青素苷和黃酮醇苷的定量分析。分析條件：柱溫40 ℃，流速0.5 mL·min-1，進(jìn)樣體積10 μL，花青素苷和黃酮醇苷的檢測(cè)波長(zhǎng)分別為530和360 nm。流動(dòng)相A液為甲醇；B液為甲酸∶水(10∶90，體積比)；C液為乙腈。線性梯度洗脫，0～40 min，B 95%～60%，C 5%～40%；45～60 min，C 100%。定量方法：分別在最大吸收波長(zhǎng)530和360 nm同時(shí)檢測(cè)花青素苷和黃酮醇苷含量。采用標(biāo)準(zhǔn)品外標(biāo)法作標(biāo)準(zhǔn)曲線定量。標(biāo)準(zhǔn)品為飛燕草素、矢車菊素、矮牽牛素、天竺葵素、錦葵素、二氫楊梅素、二氫槲皮素、楊梅素、槲皮素及山奈酚。

2 結(jié)果

2.1RHSCC比對(duì)與CIELAB顏色坐標(biāo)對(duì)紫露草花色的評(píng)價(jià) 紫露草花瓣顏色為藍(lán)紫色系(Violet group N88B)(表1)。采用國(guó)際照明委員會(huì)表色系統(tǒng)(CIELAB)對(duì)花瓣的三刺激值(亮度L*值，紅度a*值，黃度b*)進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示，紫露草花瓣花色亮度L*值為33.33，位于CIELAB色空間[8]L軸的上半軸；紅度a*值為21.12；黃度b*值為-21.39，說明紫露草花瓣的藍(lán)度較高。根據(jù)公式C*=(a*2+b*2)1/2及h=arctan(b*/a*)計(jì)算彩度C*為30.06，色相角h是314.63，在CIELAB色空間中屬于藍(lán)色向紅色過渡的區(qū)域(表1)。

表1 紫露草的花色和色值實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 1 The colors and color parameters of Tradescantia albiflora’s petals

圖1 紫露草花瓣解剖學(xué)和細(xì)胞特性Fig.1 Morphological and cell characteristics of petals of Tradescantia albiflora

2.2色素分布和表皮細(xì)胞形狀對(duì)紫露草花色形成的影響分析 通過對(duì)紫露草花瓣橫切面及表皮細(xì)胞解剖結(jié)構(gòu)(圖1)的觀察，發(fā)現(xiàn)紫露草花瓣有明顯的色素積累。色素物質(zhì)主要集中于近軸面和遠(yuǎn)軸面的表皮層，深度20～30 μm。

花瓣表皮細(xì)胞的形狀會(huì)對(duì)花色形成產(chǎn)生重要影響，一般認(rèn)為花瓣上下表皮細(xì)胞形狀不同會(huì)產(chǎn)生不同的色感，尤其是亮度(L*)差異較大。從紫露草花瓣表皮細(xì)胞掃描電鏡(圖1)可以看出，紫露草花瓣上下表皮細(xì)胞呈略扁平的長(zhǎng)方形，這可能是造成紫露草花瓣正反面顏色相似的主要原因。

2.3金屬元素對(duì)紫露草花色形成的影響分析 通過ICP-MS方法對(duì)紫露草花瓣中的金屬元素Mg、Al、Ca、Mn、Fe、Cu、Zn和Cd同時(shí)進(jìn)行分析。經(jīng)測(cè)定(表2)，發(fā)現(xiàn)紫露草花瓣中Ca元素含量極其豐富，為5 120.89 μg·g-1，是所測(cè)元素中含量第2高的Mg元素(2 360.71 μg·g-1)的2倍以上。其次為Al、Fe、Zn、Cu、Mn和Cd。

表2 紫露草花瓣中8種金屬元素的測(cè)定結(jié)果Table 2 Contents of eight metal elements in Tradescantia albiflora’s petals μg·g-1

2.4紫露草花瓣中花青素苷和黃酮醇苷的定量分析 從紫露草花瓣中共檢測(cè)出兩種花青素苷和4種黃酮醇苷。其中，在530 nm下檢測(cè)到兩種花青素苷色譜峰，出峰保留時(shí)間分別為21.20和23.77 min，這與標(biāo)樣飛燕草素、矢車菊素保留時(shí)間基本一致；在360 nm下檢測(cè)到4種黃酮醇苷色譜峰，出峰保留時(shí)間分別為28.60、44.13、47.65和49.09 min，與標(biāo)樣二氫楊梅素、槲皮素、楊梅素及山奈酚的保留時(shí)間一致。通過標(biāo)準(zhǔn)品外標(biāo)法作標(biāo)準(zhǔn)曲線定量分析得到：矢車菊素6.671 1 mg·g-1，飛燕草素0.674 4 mg·g-1，二氫楊梅素0.167 7 mg·g-1，槲皮素0.101 8 mg·g-1，楊梅素0.207 4 mg·g-1，山奈酚0.327 2 mg·g-1。計(jì)算結(jié)果表明，紫露草花瓣主要成色色素為矢車菊素和飛燕草素，含有的主要黃酮醇類物質(zhì)是山奈酚。

3 討論

3.1RHSCC比色、“CIELAB”系統(tǒng)與花色測(cè)量 花色是觀賞植物最重要的性狀之一，也是觀賞植物品種分類的重要依據(jù)。目前，常用的測(cè)色方法有目測(cè)、比色卡比色和色差儀測(cè)色。由于人們的視覺存在差異且對(duì)顏色的分類標(biāo)準(zhǔn)不同，通過目測(cè)的方法很難對(duì)花色尤其是交叉色系進(jìn)行準(zhǔn)確判定。比色卡自從1776年應(yīng)用于園藝植物顏色的測(cè)定[9]，由于其使用方便、購(gòu)置費(fèi)用低和移動(dòng)性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛使用，但是比色卡比色對(duì)試驗(yàn)者及測(cè)色環(huán)境的要求非常嚴(yán)格。目前，顏色數(shù)量化已經(jīng)成為花色深入研究的前提，因此，具有測(cè)色精度高、環(huán)境因素影響小和顏色數(shù)量化等優(yōu)點(diǎn)的色差儀在觀賞植物界花色測(cè)定方面應(yīng)用廣泛。從本研究可以看出，在目測(cè)的基礎(chǔ)上使用RHSCC比色卡比色可以較快速簡(jiǎn)便地對(duì)紫露草花色進(jìn)行評(píng)價(jià)。但是，通過色差儀可以更為準(zhǔn)確地對(duì)花瓣顏色進(jìn)行定量分析，將紫露草花瓣的色值定位于“CIELAB”色空間[8]的數(shù)字化坐標(biāo)。

3.2花瓣表皮細(xì)胞形狀對(duì)花色的影響 許多植物花瓣中的色素都是定位于表皮細(xì)胞。Quintana等[10]指出，上下表皮細(xì)胞色素可能存在明顯差異。表皮細(xì)胞的形狀不同，有圓錐形、扁平或尖形。表皮細(xì)胞的形狀可以明顯影響花色，大多數(shù)花瓣下表皮通常是扁平狀，這種結(jié)構(gòu)可以更多地反射入射光而使花色變淺。上表皮細(xì)胞常呈圓錐狀，它們可以增加進(jìn)入表皮細(xì)胞入射光的比例，提高色素對(duì)光的吸收從而增加顏色的強(qiáng)度。此外，錐形細(xì)胞還可以增強(qiáng)色彩的飽和度。Martin等[11]認(rèn)為，錐形細(xì)胞的出現(xiàn)與否與花蜜和/或花粉的聚集有關(guān)，同時(shí)，它們可能也會(huì)為傳粉昆蟲提供觸覺線索，影響花瓣的光線反射，提高花瓣的溫度，影響氣體的排放等。在本研究中，通過掃描電鏡觀察表皮細(xì)胞形狀，結(jié)果顯示，紫露草花瓣表皮細(xì)胞呈略扁平長(zhǎng)方形而非圓錐形或尖形，說明花瓣表皮細(xì)胞形狀并不是紫露草藍(lán)紫色花花色形成的主要影響因素。

3.3金屬離子對(duì)花青素呈色的影響 花最終表現(xiàn)出來的顏色是由特定色素的合成、所有色素的濃度及許多其它物理、化學(xué)及細(xì)胞方面的因素共同決定?；ㄇ嗨厥翘烊划a(chǎn)物中不穩(wěn)定的化合物之一，容易受到pH值和金屬離子等理化因素的影響。金屬元素影響色素結(jié)構(gòu)進(jìn)而影響花色。法國(guó)萬壽菊(Tagetespatula)自然花色是淺黃色，通過明礬處理會(huì)變成金黃色，鉻處理后會(huì)變成深橙色，而銅會(huì)使其變成褐色。這是由于類黃酮與槲皮素之間的轉(zhuǎn)變[12]。最近，Shoji等[13]對(duì)郁金香(Tulipagesnerianacv.Murasakizuisho)花被片底部藍(lán)色的產(chǎn)生和發(fā)展進(jìn)行了研究，整個(gè)郁金香是紫色但底部是藍(lán)色。分別收集了花的藍(lán)色和紫色不同區(qū)域的原生質(zhì)體，然后測(cè)定它們的類黃酮組成、液泡pH值和金屬元素的含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同類型的原生質(zhì)體的花青素和類黃酮組成相同，pH值存在微小差別，可是藍(lán)色原生質(zhì)體Fe3+含量是紫色的25倍。如果將Fe3+添加到紫色花色素溶液中則可以轉(zhuǎn)變?yōu)樗{(lán)色。前人的研究表明，一些二價(jià)金屬離子螯合飛燕草色素可以產(chǎn)生藍(lán)紫色花[14-16]，且花色苷、類黃酮和金屬離子按一定的化學(xué)計(jì)量比螯合的超分子金屬?gòu)?fù)合物被稱為金屬花色苷，可以顯著影響藍(lán)紫色花的著色[17]。喜馬拉雅的罌粟(Meconopsisgrandis)都是藍(lán)色的，這是由于紅色花青素通常和Mg復(fù)合存在，然后轉(zhuǎn)變成藍(lán)色[18]。Nissan-Levi等[19]研究了Mg元素在加強(qiáng)幾種觀賞植物花色方面的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，即使在高溫環(huán)境下，增加Mg元素也可以使花青素含量增加，袋鼠花(Anigozanthosflavidus)出現(xiàn)紅色的花，補(bǔ)血草(Limoniumsinuatum)長(zhǎng)出藍(lán)色苞片，絲石竹(Gypsophilaelegans)出現(xiàn)粉色花，而烏頭(Aconitumcarmichaeli)長(zhǎng)出藍(lán)色花。因此，含有不同花青素的不同植物可以通過增加Mg元素增加花色(15%～70%)。目前，關(guān)于金屬元素復(fù)合花色苷使花色趨于藍(lán)化已經(jīng)有了大量的報(bào)道，其中主要集中于金屬元素Mg、Al、Fe，而有關(guān)Ca元素的相關(guān)報(bào)道較少。在本研究中，測(cè)得紫露草花瓣中Ca元素含量極其豐富，這可能為藍(lán)紫色花花色形成機(jī)理的研究提供重要的理論依據(jù)。

[1] Kumi Y,Mihoko M,Tadao K.Blue flower color development by anthocyanins:From chemical structure to cell physiology[J].Natural Product Reports,2009,26:857-964.

[2] Yoshikazu T,Filippa B.Flower colour and cytochromes P450[J].Philosophical Transactions of the Royal Society Biological Sciences,2013,368:1-14.

[3] Yoshida K,Kondo T,Okazaki Y,etal.Cause of blue petal colour[J].Nature,1995,373:291.

[4] Shibata K,Shibata Y,Kashiwagi I.Studies on anthocyanins:Color variation in anthocyanins[J].Journal of the American Chemical Society,1919,41:208-220.

[5] 白新祥.菊花花色形成的表型分析[D].北京:北京林業(yè)大學(xué),2007.

[6] Di Stilio V S,Martin C,Schulfer A F,etal.An ortholog of MIXTA-like 2 controls epidermal cell shape in flowers ofThalictrum[J].New Phytologist,2009,183(3):718-728.

[7] Miller R,Owens S J,R?rslett B.Plants and colour:Flowers and pollination[J].Optics & Laser Technology,2011,43:282-294.

[8] Voss D H.Relating colorimeter measurement of plant color to the Royal Horticultural Society Colour Chart[J].Hortscience,1992,27:1256-1260.

[9] Tueher A O,Maciarello M J,Tueker S S.A survey of color charts for biological description[J].International Association for Plant Taxonomy,1991,40:201-214.

[10] Quintana A,Albrechtova J,Griesbach R J,etal.Anatomical and biochemical studies of anthocyanidins in flowers ofAnagallismonelliL.(Primulaceae) hybrids[J].Scientia Horticulturae,2007,112:413-421.

[11] Martin C,Lara-Palermo S,Nichols J,etal.Evolution of flower development:From phenotypes to genes[A].In:Chou C H.Abstract for Botany & Plant Biology 2007 Joint Congress[C].Chicago:California State University Press,2007:229-239.

[12] Cannon J,Cannon M.Dye Plants and Dyeing[M].London:The Herbert Press,1994.

[13] Shoji K,Miki N,Nakajima N,etal.Perianth bottom-specific blue color development in tulip cv.Murasakizuisho requires ferric ions[J].Plant & Cell Physiology,2007,48:243-251.

[14] Goto T,Kondo T.Structure and molecular stacking of anthocyanins-flower color variation[J].Angewandte Chemical International Edition,1991,30:17-33.

[15] Takeda K,Hayashi K.Reconstruction of commelinin from its components,awobanin,flavocommelin and magnesium[J].Proceedings of the Japan Academy,1977,53:1-5.

[16] Kondo T,Yoshida K,Nakagawa A,etal.Structural basis of blue-colour development in flower petals fromCommelinacommunis[J].Nature,1992,358:515-518.

[17] 楊少勇，安銀玲，樊國(guó)盛，等.藍(lán)色花植物花色素的著色機(jī)理[J].北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2003,25(5):68-76.

[18] Kumi S,Kitahara D I,etal.Ferric ions involved in the flower color development of the himalayan blue poppyMeconopsisgrandis[J].Phytochemistry,2006,7:992-998.

[19] Nissan-Levi A,Ovadia R,Foreer I,etal.Increased anthocyanin accumulation in ornamental plants due to magnesium treatment[J].Journal of Horticultural Science and Biotechnology,2007.82:481-487.