土埋15年尸骨DNA檢驗(yàn)1例

楊耕野，李呈核，韓海軍

（1.南通市公安局刑警支隊(duì)，江蘇南通 226007；2.南通市公安局交巡警支隊(duì)，江蘇南通 226007）

土埋15年尸骨DNA檢驗(yàn)1例

楊耕野1，李呈核2，韓海軍1

（1.南通市公安局刑警支隊(duì)，江蘇南通 226007；2.南通市公安局交巡警支隊(duì)，江蘇南通 226007）

法醫(yī)遺傳學(xué)；DNA；骨骼；牙

1 案例

1.1 簡(jiǎn)要案情

1997年12月，田某將其養(yǎng)女殺死后逃竄。2012年9月，經(jīng)調(diào)查懷疑田某在案發(fā)后第3天被燒死在一河堤上，尸體已被當(dāng)?shù)鼐窖诼裼诘叵拢诔鍪w后，提取其部分四肢骨和牙齒以及田某妻子、女兒血樣送檢，以確定尸源。

1.2 檢驗(yàn)過(guò)程

取該尸體股骨1根、左下頜第三磨牙和左下頜第二磨牙，清洗檢材后備檢。

股骨DNA的提?。河玫镀腥」晒枪趋慷斯撬少|(zhì)約0.4g，切碎后置于2mL離心管，加入1mL 0.5mol/L EDTA脫鈣液（pH=8.0），置于恒溫振蕩器56℃脫鈣24h，期間更換4次EDTA脫鈣液。用TES緩沖液代替EDTA脫鈣液洗滌沉淀物1次，加入TES緩沖液500 μL、10%SLS裂解液100 μL、10 mg/mL PK裂解液50μL、1mol/L DTT液50μL，振蕩混勻后置于恒溫振蕩器56℃中保存2h，按文獻(xiàn)[1]所述方法提取DNA。

牙齒DNA的提?。簩深w牙齒分別敲碎后置于兩支2mL離心管并做好標(biāo)記，每管加入TES緩沖液500 μL、10%SLS裂解液100 μL、10 mg/mL PK裂解液50μL、1mol/L DTT液50μL，振蕩混勻后置于恒溫振蕩器56℃中保存2h，轉(zhuǎn)移至99℃保溫10min。將上述消化液轉(zhuǎn)移至另一2mL離心管內(nèi)，用1.2mL吸附液分3次洗滌消化過(guò)的牙齒碎塊，并將洗滌后的液體全部轉(zhuǎn)移至離心管中，以離心半徑5cm，12000r/min，離心2 min，上清液分別轉(zhuǎn)移至新的2 mL離心管中。按文獻(xiàn)[1]所述方法提取DNA，模板用15 μL TE液溶解。

對(duì)照血樣DNA（田某妻子、女兒血樣）的提取按文獻(xiàn)[2]所述方法進(jìn)行。

將股骨、牙齒及對(duì)照血樣的DNA分別采用Identifiler Plus試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增，采用10μL體系，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)3500XL遺傳分析儀進(jìn)行檢測(cè)，GeneMapper IDX軟件進(jìn)行基因分型。

分型結(jié)果見(jiàn)圖1～3，該尸體的股骨和牙齒均與對(duì)照血樣不符合親緣關(guān)系。左下頜第三磨牙擴(kuò)增產(chǎn)物的15個(gè)基因座均獲得了質(zhì)量較好的STR分型結(jié)果，而左下頜第二磨牙在D7S820、D18S51等大片段基因座上出現(xiàn)了非特異性擴(kuò)增和漏擴(kuò)的情況，圖譜質(zhì)量較差。

圖1 股骨骨骺端骨松質(zhì)STR分型圖譜

圖2 左下頜第三磨牙STR分型圖譜

圖3 左下頜第二磨牙STR分型圖譜

2 討論

骨骼和牙齒是法醫(yī)DNA檢驗(yàn)中較為常見(jiàn)的生物檢材。骨組織內(nèi)的細(xì)胞由于被鈣化的細(xì)胞外基質(zhì)所保護(hù)，可以得到長(zhǎng)久的保存，這是陳舊尸骨DNA檢驗(yàn)的基礎(chǔ)，但這種保護(hù)也給骨細(xì)胞的裂解帶來(lái)很大困難，EDTA脫鈣是目前比較常用的方法[1]，脫鈣的時(shí)間一般要大于24h。牙齒由牙釉質(zhì)、牙本質(zhì)、牙骨質(zhì)3種鈣化的硬組織和牙髓軟組織組成，硬組織的結(jié)構(gòu)與骨密質(zhì)相似，裂解其內(nèi)的細(xì)胞也需要脫鈣，而牙髓組織含有豐富的血管和神經(jīng)，位于牙腔內(nèi)，由3種堅(jiān)硬的鈣化組織保護(hù)著[3]，牙根尖處僅有的開(kāi)口又往往受到上下頜骨的保護(hù)，對(duì)外界環(huán)境因素也有很強(qiáng)的抵抗力，所以提取牙髓組織的DNA時(shí)，只需要充分暴露牙腔，即可直接對(duì)牙髓內(nèi)的細(xì)胞進(jìn)行裂解。本案例中，對(duì)牙齒的處理采用了粉碎牙齒、暴露牙腔后通過(guò)蛋白酶直接消化牙髓的方法，所以在時(shí)間上就比骨組織的檢驗(yàn)周期大大縮短，在牙髓保存完好的情況下檢驗(yàn)效果也比較好。

此外，牙齒的選取也會(huì)直接影響檢驗(yàn)的效果。第三磨牙又稱智齒，萌出時(shí)間最晚，通常在青春期才萌出，此時(shí)頜骨發(fā)育已近成熟，若頜骨沒(méi)有給智齒的發(fā)育留出足夠的空間，會(huì)影響其正常萌出[4]。分析本案例，左下頜第三磨牙就屬于阻生牙，其牙冠的咬合面無(wú)法與上頜牙齒磨合，反致牙冠各面均保持得非常完好，其內(nèi)部的牙髓也就得到了較好的保存，而第二磨牙為齲齒，牙冠有破壞的痕跡，可能導(dǎo)致牙腔暴露，不利于牙髓的保護(hù)。所以在檢案中可選擇第三磨牙或牙冠無(wú)破壞的磨牙，以得到更為完整的STR分型結(jié)果。

[1]賈東濤，韓海軍，張玉紅，等.陳舊骨骼DNA提取方法的應(yīng)用研究[J].中國(guó)法醫(yī)學(xué)雜志，2007，22（4）：260-261.

[2]王林生，蘇勇，顧林崗.硅珠法提取PCR模板DNA[J].中國(guó)法醫(yī)學(xué)雜志，2000，15（1）：36-37.

[3]毛祖彝.口腔科學(xué)[M].第3版.北京：人民衛(wèi)生出版社，1991：3.

[4]柏樹令，應(yīng)大君.系統(tǒng)解剖學(xué)[M].第6版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2004：121.

DF795.2

B

10.3969/j.issn.1004-5619.2013.04.028

1004-5619（2013）04-0319-02

2013-03-14）

（本文編輯：李成濤）

楊耕野（1986—），男，黑龍江哈爾濱人，主要從事法醫(yī)物證鑒定工作；E-mail：yanggengye@yahoo.com.cn