應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)判定現(xiàn)場(chǎng)物證生物屬性

許炎，張晨，徐慶文，黃江平，劉亞楠，鄒凱南，平原，周懷谷

（上海市公安局物證鑒定中心法醫(yī)物證學(xué)現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用技術(shù)公安部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200083）

應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)判定現(xiàn)場(chǎng)物證生物屬性

許炎，張晨，徐慶文，黃江平，劉亞楠，鄒凱南，平原，周懷谷

（上海市公安局物證鑒定中心法醫(yī)物證學(xué)現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用技術(shù)公安部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200083）

目的 探尋分子生物學(xué)方法判定刑事案件現(xiàn)場(chǎng)物證的生物屬性的可行性。方法取30份現(xiàn)場(chǎng)生物檢材，其中血液（斑）、唾液（斑）、精液（斑）各10份，分別進(jìn)行常規(guī)檢驗(yàn)法和分子生物學(xué)方法，通過(guò)DNARNA共提取技術(shù)，將其中的mRNA運(yùn)用反轉(zhuǎn)錄PCR（reverse transcription PCR，RT-PCR）技術(shù)反轉(zhuǎn)錄成cDNA，根據(jù)3種生物檢材不同的目標(biāo)基因設(shè)計(jì)3對(duì)特異性引物，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，通過(guò)熔解曲線(xiàn)測(cè)定不同的熔解溫度（Tm）和不同長(zhǎng)度的擴(kuò)增片段來(lái)區(qū)分生物檢材。結(jié)果血液（斑）的Tm值為（84.5± 0.2）℃，片段長(zhǎng)度177bp；唾液（斑）的Tm值為（76.9±0.3）℃，片段長(zhǎng)度134bp；精液（斑）的Tm值為（88.5± 0.2）℃，片段長(zhǎng)度294bp。結(jié)論與常規(guī)檢驗(yàn)法比較，聯(lián)合應(yīng)用RT-PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)判定檢材的生物屬性特異性強(qiáng)、靈敏度高、結(jié)果穩(wěn)定可靠，可應(yīng)用于日常法醫(yī)物證檢驗(yàn)。

法醫(yī)遺傳學(xué)；反轉(zhuǎn)錄PCR；實(shí)時(shí)熒光定量PCR；血液；唾液；精液

判定刑事案件中人體遺留的生物來(lái)源斑跡的屬性，是法醫(yī)物證工作者的一項(xiàng)首要任務(wù)和重要工作，為后期的DNA成功檢驗(yàn)提供保障，同時(shí)也為案件偵破指明方向。血液（斑）、唾液（斑）、精液（斑）是案件中最常見(jiàn)的3種生物物證，在日常法醫(yī)物證工作中，常規(guī)檢驗(yàn)法普遍使用的是基于酶聯(lián)免疫反應(yīng)的金標(biāo)試劑條和化學(xué)顯色反應(yīng)法判定檢材的生物屬性。雖然這些方法有快速、簡(jiǎn)便以及經(jīng)濟(jì)的優(yōu)勢(shì)，但特異性不高，會(huì)出現(xiàn)假陰性或假陽(yáng)性的結(jié)果，還需損耗檢驗(yàn)樣品，對(duì)于一些案件中有重要價(jià)值的極微量檢材，會(huì)造成嚴(yán)重的后果。

近年來(lái)分子生物學(xué)技術(shù)理論不斷發(fā)展，細(xì)胞特異性的mRNA表達(dá)分析技術(shù)正成為判定檢材生物屬性的一種全新的方法，如血液（斑）、唾液（斑）、精液（斑）均有各自的細(xì)胞特異性基因標(biāo)記，即膽色素原脫氨酶（porphobilinogen deaminase，PBGD）、富組蛋白3（histatin 3，HTN3）、（魚(yú)）精蛋白2（protamine 2，PRM2）等[1-3]。通過(guò)NCBI檢索可以得到不同生物檢材各自的全長(zhǎng)功能基因以此設(shè)計(jì)不同的引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增得到相應(yīng)的目標(biāo)基因。

本研究聯(lián)合運(yùn)用反轉(zhuǎn)錄PCR（reverse transcription PCR，RT-PCR）以及實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)擴(kuò)增得到相應(yīng)的目標(biāo)基因，并運(yùn)用DNA-RNA共提取方法[4]，一次抽提同時(shí)完成前期生物屬性判定和后期DNA檢驗(yàn)。

1 材料與方法

1.1 樣本

血液（斑）樣本共10份：2份取自室內(nèi)非正常死亡的2名死者的新鮮血液各100 μL，滴在1 cm×4 cm吸水濾紙上制成血痕，作為陽(yáng)性對(duì)照；4份室內(nèi)現(xiàn)場(chǎng)地面常規(guī)量新鮮血跡；4份分別取自木柄、墻面、門(mén)把手、衣服的微量血痕。

唾液（斑）樣本共10份：2份取自2名健康男性志愿者的口腔拭子，作為陽(yáng)性對(duì)照；4份來(lái)源為4名被害人現(xiàn)場(chǎng)采集的常規(guī)量口腔拭子；4份分別取自2封信件郵票背面的涂取物、1瓶現(xiàn)場(chǎng)提取的飲料瓶以及1份嚼過(guò)的口香糖中的微量唾斑。

精液（斑）樣本共10份：2份取自2名健康男性志愿者的精液各20 μL，作為陽(yáng)性對(duì)照；4份來(lái)源為4名嫌疑人遺留的避孕套中的常規(guī)量精液；4份分別取自床單、紙巾、內(nèi)褲和陰道拭子中的微量精斑。

1.2 常規(guī)檢驗(yàn)

血液（斑）樣本：將10份樣本用抗人血金標(biāo)試劑條FOB（公安部二所物證鑒定中心）檢測(cè)，按說(shuō)明書(shū)操作。

唾液（斑）樣本：將10份樣本用淀粉-碘顯色反應(yīng)（自配）檢測(cè)，按技術(shù)手冊(cè)規(guī)范操作[5]。

精液（斑）樣本：將10份樣本用抗人精金標(biāo)試劑條PSA（公安部二所物證鑒定中心）檢測(cè)，按說(shuō)明書(shū)操作。

1.3 DNA-RNA共提取

將所有樣本按照AllPrepTMDNA/RNA Micro試劑盒（美國(guó)QIAGEN公司）說(shuō)明書(shū)操作?？俁NA用于反轉(zhuǎn)錄，基因組DNA用于定量和STR分型。

1.4 RNA反轉(zhuǎn)錄

將所有樣本各自抽提的總RNA，使用TaqMan? Gold RT-PCR試劑盒（美國(guó)AB公司）說(shuō)明書(shū)操作。反應(yīng)體系均為10 μL，包括：10×TaqMan RT緩沖液1 μL、25 mmol/L MgCl22.2 μL、10 mmol/L dNTPs Mix 2μL、50μmol/L Oligo d（T）160.5μL、20U/μ LRNase抑制劑0.2 μL、50 U/μL MultiScribe反轉(zhuǎn)錄酶0.25 μL、RNA模板3.85 μL。反應(yīng)條件為：25℃10 min，48℃30min，95℃5min。反應(yīng)產(chǎn)物均為cDNA。

1.5 cDNA實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增

使用2×QuantiTechTMSYBR?Green PCR Master Mix試劑盒（美國(guó)QIAGEN公司），引物參照表1，配成10 μmol各取1 μL。反應(yīng)體系為25 μL，包括：QuantiTechTMSYBR?Green PCR Master Mix（2×）12.5μL、10 mol/L引物（正向、反向）各1.25 μL、cDNA模板10μL。7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增儀進(jìn)行檢測(cè)。擴(kuò)增條件：95℃15min；95℃20s，55℃20s，72℃30s，40個(gè)循環(huán)；95℃15s，60℃1min，95℃15s。收集熔解曲線(xiàn)。

表1 不同生物檢材樣本的特定基因引物序列

1.6 擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳分析

各取5 μL PCR產(chǎn)物，用2%瓊脂糖膠于1×TAE緩沖液中，150V電壓電泳30min，EB染色，紫外光下觀(guān)察條帶。

1.7 DNA定量和STR分型

用QuantifilerTMhuman DNA定量試劑盒（美國(guó)AB公司）參照技術(shù)手冊(cè)在7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上對(duì)基因組DNA進(jìn)行TaqMan熒光探針?lè)ǘ浚磻?yīng)體系為25 μL，包括：QuantifilerTMPCR Reaction Mix 12.5μL、QuantifilerTMHuman Primer Mix 10.5μL、DNA模板：2 μL。根據(jù)定量結(jié)果再按技術(shù)手冊(cè)程序用AmpF?STR?Identifiler?試劑盒（美國(guó)AB公司）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為25 μL，后將擴(kuò)增產(chǎn)物在3100XL遺傳分析儀（日本HITACHI公司）上進(jìn)行電泳。用GeneMapper v3.2進(jìn)行DNA片段分析，觀(guān)察STR基因座檢出數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 不同生物檢材的熔解曲線(xiàn)

除唾液樣本郵票1涂取物和精液樣本陰道拭子上精斑外，其他樣本均得到與陽(yáng)性對(duì)照相同的特異性的熔解曲線(xiàn)。陽(yáng)性對(duì)照的血液（斑）、唾液（斑）、精液（斑）的熔解曲線(xiàn)見(jiàn)圖1，不同生物屬性的檢材有明顯特異性的溶解曲線(xiàn)峰，與理論值相符。3種生物檢材的熔解溫度（Tm）見(jiàn)表2。

圖1 3種生物檢材的熔解曲線(xiàn)圖

表2 不同生物檢材的Tm值（n=10，±s，℃）

表2 不同生物檢材的Tm值（n=10，±s，℃）

檢材類(lèi)型Tm血液（斑）84.5±0.2唾液（斑）76.9±0.3精液（斑）88.5±0.2

2.2 電泳結(jié)果顯示的擴(kuò)增基因片段長(zhǎng)度

不同生物檢材電泳條帶清晰單一，擴(kuò)增產(chǎn)物片段長(zhǎng)度準(zhǔn)確，血液（斑）片段長(zhǎng)度177bp、唾液（斑）片段長(zhǎng)度177 bp、精液（斑）片段長(zhǎng)度294 bp，經(jīng)割膠回收后測(cè)序驗(yàn)證，結(jié)果與目的基因序列完全一致（圖2）。

圖2 血液（斑）、精液（斑）和唾液（斑）特異性基因片段的電泳圖

2.3 與常規(guī)檢驗(yàn)的比較

在常規(guī)檢驗(yàn)與分子生物學(xué)方法中，血液（斑）、唾液（斑）、精液（斑）的常規(guī)量12份樣本以及陽(yáng)性對(duì)照6份樣本，均得到相同結(jié)果，顯示為陽(yáng)性，且全部獲得清晰的STR分型圖譜以及16個(gè)位點(diǎn)。而在12份微量樣本中，常規(guī)檢驗(yàn)與分子生物學(xué)方法存在差異（表3）。

表3 實(shí)際案件中不同生物微量檢材兩種方法的比較

微量血痕的常規(guī)檢驗(yàn)法顯示為陽(yáng)性的，分子生物學(xué)方法全部獲得清晰的STR分型圖譜（16個(gè)位點(diǎn)），每個(gè)基因座都有一個(gè)基因峰（純合子）或兩個(gè)基因峰（雜合子），峰高大于100相對(duì)熒光強(qiáng)度單位；微量血痕的常規(guī)檢驗(yàn)法顯示為陰性的，分子生物學(xué)方法部分獲得STR分型圖譜（14個(gè)位點(diǎn)）。

微量唾斑的常規(guī)檢驗(yàn)法顯示為陽(yáng)性的，分子生物學(xué)方法全部或部分獲得STR分型圖譜（＜10個(gè)位點(diǎn)）；微量唾斑的常規(guī)檢驗(yàn)法顯示為陰性的，分子生物學(xué)方法未獲得STR分型圖譜。

微量精斑的常規(guī)檢驗(yàn)法顯示為陽(yáng)性的，分子生物學(xué)方法可能全部獲得或未獲得STR分型圖譜。

3 討論

在法醫(yī)物證檢驗(yàn)工作中，明確檢材的生物屬性是首要目標(biāo)，決定了后續(xù)DNA檢驗(yàn)的方法和成敗。檢驗(yàn)樣本微量化是今后面臨的巨大挑戰(zhàn)，顯然傳統(tǒng)的免疫金標(biāo)法無(wú)法適應(yīng)這一趨勢(shì)。本研究選擇刑事案件中常見(jiàn)的三大生物檢材血液（斑）、唾液（斑）、精液（斑）作為研究對(duì)象，運(yùn)用分子生物學(xué)技術(shù)特異性擴(kuò)增目標(biāo)基因，通過(guò)熔解曲線(xiàn)和基因片段長(zhǎng)度來(lái)判定檢材的生物屬性，為案件后續(xù)DNA檢驗(yàn)提供線(xiàn)索。

近年來(lái)，RNA技術(shù)是法醫(yī)物證學(xué)領(lǐng)域中一大研究熱點(diǎn)，如判定血痕形成時(shí)間、特定基因在組織中表達(dá)譜等[6-7]。本研究應(yīng)用RNA技術(shù)快速判定檢材的生物屬性，其原理是抽提細(xì)胞內(nèi)總RNA經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增為功能性DNA（cDNA），通過(guò)篩選血液（斑）、唾液（斑）、精液（斑）各自的標(biāo)記性基因來(lái)設(shè)計(jì)不同的特異性引物，最后經(jīng)實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增觀(guān)察熔解曲線(xiàn)和基因片段長(zhǎng)度來(lái)區(qū)分檢材的生物屬性。該方法在特異性方面較傳統(tǒng)的免疫金標(biāo)試劑條具有明顯的優(yōu)勢(shì)，克服了假陰性、假陽(yáng)性的缺點(diǎn)。本研究中，墻面上血跡FOB試劑條顯示陰性，但得到血液特異性的熔解曲線(xiàn)和目的基因，并成功獲得絕大部分STR分型；陰道拭子中PSA試劑條顯示陽(yáng)性，但未得到精液特異性的熔解曲線(xiàn)和目的基因，也未獲得STR分型。從以上兩個(gè)案例中，可以得知墻面上血跡中血紅細(xì)胞本身數(shù)量較少且紅細(xì)胞沒(méi)有細(xì)胞核比白細(xì)胞脆弱，在滲透或外力作用下被大量破壞，低于試劑條的檢測(cè)閾值，出現(xiàn)假陰性結(jié)果。而PSA試劑條是根據(jù)人精漿前列腺特異性抗原P30，與精液中有無(wú)精子沒(méi)有關(guān)系。陰道拭子中可能僅有P30，并無(wú)精子（實(shí)驗(yàn)過(guò)程中鏡檢也未檢見(jiàn)精子），出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果。上述結(jié)果說(shuō)明DNA檢驗(yàn)與運(yùn)用RNA判定生物屬性的方法都是在基因水平的檢測(cè)，而免疫金標(biāo)法卻是在蛋白水平上的檢測(cè)，F(xiàn)OB試劑針對(duì)血紅蛋白而非白細(xì)胞，PSA針對(duì)P30而非精子細(xì)胞，因此特異性不高。本研究運(yùn)用分子生物學(xué)技術(shù)判定是否為唾液（斑）的方法，較淀粉-碘顯色反應(yīng)更精確、特異性更強(qiáng)，與DNA檢驗(yàn)結(jié)果相吻合。

此外，本研究采用DNA-RNA共提取方法，可以做到一次分離、多種用途，最大程度地利用有限的生物檢材，蛋白質(zhì)可以用免疫酶聯(lián)試劑條做前期檢驗(yàn)（與后面的RNA方法作相互驗(yàn)證）、RNA通過(guò)反轉(zhuǎn)錄成為功能性cDNA用于判定檢材的生物屬性和推斷生物檢材的形成時(shí)間、基因組DNA可用于STR分型。該技術(shù)尤其適用于重特大案件中重要且微量的生物檢材的檢驗(yàn)，在一次檢驗(yàn)過(guò)程中得到多種信息，既經(jīng)濟(jì)又快速。

運(yùn)用RT-PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)判定現(xiàn)場(chǎng)檢材的生物來(lái)源屬性，較傳統(tǒng)的免疫酶聯(lián)試劑條前期檢驗(yàn)方法具有特異性強(qiáng)、同步檢驗(yàn)并最大程度利用樣本的優(yōu)勢(shì)，尤其適用于微量檢材。

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[5]侯一平.法醫(yī)物證學(xué)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2009：337.

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[7]Bauer M.RNA in forensic science[J].Forensic Sci Int Genet，2007，1（1）：69-74.

Determination of the Biological Attribute of Evidence at the Scene Using Reverse Transcription PCR and Real-time Fluorescent Quantitative PCR

XU Yan,ZHANG Chen,XU Qing-wen,HUANG Jiang-ping,LIU Ya-nan,ZOU Kai-nan,PING Yuan, ZHOU Huai-gu
（Key Laboratory of Forensic Evidence and Science Technology,Ministry of Public Security,Institute of Forensic Science,Shanghai Public Security Bureau,Shanghai 200083,China）

ObjectiveTo explore the feasibility of biological method to identify the biological attribute of samples at crime scene.MethodsThirty samples of ten blood stains,ten saliva stains and ten semen stains were selected,and all the samples were processed by the routine method and biomolecular method,respectively.Both RNA and DNA were isolated using DNA-RNA co-extraction technology and the mRNA was converted into cDNA using reverse transcription PCR（RT-PCR）.Three pairs of specific primers were designed for blood stain,saliva stain and semen stain based on the different target genes in three specific tissues and the primers were amplified using real-time fluorescent quantitative PCR.The differences in these biological samples were evaluated by melting temperature（Tm）values and the size of the amplification fragment.ResultsThe Tm values of blood stain,saliva stain and semen stain were（84.5±0.2）℃,（76.9±0.3）℃and（88.5±0.2）℃,respectively.The length of PCR fragments of them was 177 bp,134 bp and 294 bp,respectively.ConclusionCompared with the routine method,RT-PCR with real-time fluorescent quantitative PCR is highly specific,sensitive and reliable to identify the biological attribute of evidence,and can be potentially applied to determine evidence attribute in forensic practice.

forensic genetics;reverse transcriptase polymerase chain reaction;real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction;blood;saliva;semen

DF795.2

A

10.3969/j.issn.1004-5619.2013.04.006

1004-5619（2013）04-0259-04

2012-10-08）

（本文編輯：李成濤）

公安部科技強(qiáng)警基礎(chǔ)工作專(zhuān)項(xiàng)項(xiàng)目（2012GABJC005）

許炎（1980—），男，江蘇蘇州人，博士研究生，主檢法醫(yī)師，主要從事法醫(yī)DNA分析技術(shù)的應(yīng)用和研究；E-mail：xxnnxy@hotmail.com

周懷谷，男，博士，主任法醫(yī)師，主要從事法醫(yī)DNA分析技術(shù)的應(yīng)用和研究；E-mail：hgzhou803@hotmail.com