預(yù)防性應(yīng)用槲皮素對(duì)吸入性損傷大鼠肺治療效果的影響

劉婭平，張建明，劉 群，馮世海，趙永健，施 耘，肖長(zhǎng)栓

（1.天津醫(yī)科大學(xué)研究生院，天津300070；2.天津市第四醫(yī)院燒傷科，天津300222）

吸入性損傷是一種多數(shù)發(fā)生在封閉火場(chǎng)、病情發(fā)展迅猛的燒傷危重癥，患者的死亡率極高。雖然有研究證明某些炎癥介質(zhì)參與了吸入性損傷及其全身繼發(fā)性損害，但尚無控制這些炎癥因子的臨床治療方法。使用有效藥物及其給藥時(shí)間可能對(duì)患者病情發(fā)展有較強(qiáng)的干預(yù)作用。有研究表明，槲皮素具有清除氧自由基的作用，在慢性阻塞性肺疾病大鼠模型中，槲皮素通過抑制活性氧和活性氮起到抗氧化應(yīng)激的作用[1]。對(duì)吸入性肺損傷的作用尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)通過槲皮素對(duì)大鼠煙霧吸入性損傷模型的預(yù)防性治療作用，研究其對(duì)自由基及炎癥介質(zhì)的影響及對(duì)肺水清除的作用，探討其對(duì)煙霧吸入性肺損傷的預(yù)防和治療作用。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器 槲皮素（Sigma公司），IL-6ELISA試劑盒、TNF-αELISA試劑盒（美國(guó)R&D公司），大鼠SOD試劑盒、MDA試劑盒、iNOS試劑盒（南京建成公司），光學(xué)顯微鏡（OLYMPUS），ELX800UV酶標(biāo)檢測(cè)儀（BIO-TEK），微量加樣器（eooendorf），Centrifuge5702離心機(jī)（EPPENDORF公司），LEICA石蠟切片機(jī)。

1.2 動(dòng)物分組及處理 雄性SD大鼠40只，體質(zhì)量（200±20）g（天津春樂實(shí)驗(yàn)動(dòng)物提供）。采用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為4組：正常對(duì)照組（A組）、致傷空白組（B組）、槲皮素治療組（C組）、槲皮素預(yù)防組（D組），每組10只。D組在致傷前10min腹腔注射槲皮素（200mg/kg）。除A組外，其余各組參照相關(guān)文獻(xiàn)[2]制作大鼠煙霧吸入性損傷模型。C組在致傷后3h腹腔注射槲皮素（200mg/kg），B組于致傷后3h腹腔注射等量的生理鹽水，A組無處理。上述過程中無大鼠死亡等意外情況發(fā)生。

1.3 標(biāo)本采集 各組于傷后72h取腹主動(dòng)脈血5mL，以3000r/min離心15min后，留上清液，于-20℃冰箱凍存待測(cè)TNF-α，IL-6。將大鼠處死，取其左肺迅速凍存于-70℃冰箱中待測(cè)MDA、SOD、iNOS。以4%甲醛灌洗肺動(dòng)脈，以右肺用絲線扎緊肺門，置于4%甲醛中固定，留待做病理切片檢查。取少量右肺組織做肺組織干濕比。

1.4 指標(biāo)檢測(cè) （1）按照試劑盒說明書以雙抗體夾心ELISA法測(cè)血清IL-6（pg/mL）、TNF-α（ng/L）含量。（2）用濾紙將肺組織表面吸凈，制成勻漿，采用考馬斯亮藍(lán)蛋白測(cè)定法測(cè)勻漿液中蛋白濃度。參照試劑盒說明書，分別測(cè)定SOD（U/mg）、MDA（nmol/ mg）、iNOS（U/mg）活力。（3）將留待病理以4%甲醛固定好的右肺組織脫水、石蠟包埋、切片，在蘇木精-伊紅（HE）染色后行光鏡觀察。（4）取少量右肺組織稱重后置于80℃恒溫烤箱中48h，取出稱干重，肺含水量=（肺濕重-肺干重）/肺干重。

2 結(jié)果

2.1 肺病理切片檢查 光學(xué)顯微鏡下，A組肺泡腔結(jié)構(gòu)清晰，肺泡間隔均勻，肺泡壁均勻光滑（圖1）。B組組織表現(xiàn)為肺泡不同程度擴(kuò)張或萎陷，大小形態(tài)明顯異常，肺泡結(jié)構(gòu)模糊不清，肺泡間隔不均勻，肺間質(zhì)和肺泡壁內(nèi)可見中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)（圖2）。C組組織水腫較B組明顯減輕，部分肺泡大小形態(tài)可見異常，毛細(xì)血管擴(kuò)張，管周仍有少量紅、白細(xì)胞浸潤(rùn)，肺間質(zhì)及肺泡腔內(nèi)炎癥細(xì)胞滲出輕于B組（圖3）。D組損傷程度又小于C組（圖4）。

2.2 各組大鼠血清TNF-α、IL-6水平的比較 見表1。與A組比較，B、C、D組IL-6及TNF-α水平明顯升高（P<0.01）。與B組比較，C、D組TNF-α水平及IL-6水平顯著降低（P<0.01）。與C組比較，D組TNF-α水平及IL-6水平顯著降低（P<0.01）。

表1 各組大鼠血清TNF-α、IL-6水平比較（±s）Tab 1 Comparison of TNF-α,IL-6in the serum of the rats in each group（±s）

表1 各組大鼠血清TNF-α、IL-6水平比較（±s）Tab 1 Comparison of TNF-α,IL-6in the serum of the rats in each group（±s）

與A組相比#P<0.01，▲P<0.01，△P<0.01；與B組相比#P<0.01，▲P<0.01；與C組相比#P<0.01

組別A組B組C組D組n 10101010TNF-α/(pg/mL）106.12±3.07245.92±2.51△209.61±5.85▲158.23±4.43# IL-6/(pg/mL) 140.21±26.15210.04±2.02△182.59±4.08▲150.89±2.89#

2.3 各組大鼠肺組織MDA、SOD、iNOS水平的比較 見表2。與A組比較，B、C、D組MDA及iNOS水平顯著升高（P<0.01），SOD水平顯著降低（P< 0.01）。與B組比較，C、D組MDA、iNOS含量顯著降低（P<0.01），SOD水平顯著升高（P<0.01）。與C組比較，D組MDA、iNOS含量顯著降低（P<0.01），SOD水平顯著升高（P<0.01）。

表2 各組大鼠肺組織MDA、iNOS、SOD水平比較（±s）Tab 2 Comparison of SOD,iNOS，MDA in the lung tissue of rats in each group（±s）

表2 各組大鼠肺組織MDA、iNOS、SOD水平比較（±s）Tab 2 Comparison of SOD,iNOS，MDA in the lung tissue of rats in each group（±s）

與A組相比#P<0.01，▲P<0.01，△P<0.01；與B組相比▲P<0.01，#P<0.01；與C組相比#P<0.01

組別A組B組C組D組n 10101010MDA/(nmol/mg) 2.39±0.154.06±0.35△3.65±0.46▲2.97±0.56# iNOS/（U/mg) 0.77±0.412.01±0.26△1.74±0.31▲1.25±0.32# SOD/（U/mg) 361.32±2.0852.03±0.64△254.35±1.15▲312.67±0.98#

2.4 各組大鼠肺組織含水量的比較 見表3。與A組比較，B、C、D組肺含水量均升高（P<0.01）。與B組比較，C、D組肺含水量均降低（P<0.01）。與C組比較，D組肺含水量降低（P<0.05）。

表3 各組大鼠肺組織含水量的比較（±s）Tab 3 Comparison of the water content of the lung tissue of rats in each group（±s）

表3 各組大鼠肺組織含水量的比較（±s）Tab 3 Comparison of the water content of the lung tissue of rats in each group（±s）

與A組相比#P<0.01，▲P<0.01，△P<0.01；與B組相比，▲P<0.01，#P<0.01；與C組相比#P<0.01

組別A組B組C組D組n 10101010肺組織含水量/（g/g) 3.34±0.657.76±0.35△6.45±0.76▲5.57±0.86#

3 討論

研究表明，自由基產(chǎn)生和釋放的增加導(dǎo)致的應(yīng)激反應(yīng)在肺損傷的發(fā)病機(jī)制中十分重要[3]，當(dāng)機(jī)體清除氧自由基的能力下降時(shí)，肺組織產(chǎn)生的氧自由基最易損傷肺臟的組織細(xì)胞從而造成肺損傷。槲皮素的化學(xué)名稱為（3,3,4,5,7-）五羥基黃酮，具有酚羥基，屬于黃酮類化合物中的黃酮醇亞類，黃酮類化合物的酚羥基H就是與自由基反應(yīng)的最大可能活性部位，通過與自由基發(fā)生抽氫反應(yīng)消除自由基起到抗氧化作用。槲皮素可憑借其含有的酚羥基基團(tuán)發(fā)揮清除自由基和抗過氧化的作用。槲皮素具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化、抗血小板聚集和清除自由基等多種生物學(xué)活性[4]，吸入性損傷也具有上述病變中存在的過氧化等問題，因此筆者推斷槲皮素可能對(duì)吸入性肺損傷具有良好的預(yù)防和治療效果。

本實(shí)驗(yàn)病理切片顯示致傷組大鼠肺泡不同程度擴(kuò)張或萎陷，肺泡毛細(xì)血管擴(kuò)張充血，肺泡間隔不均勻，證明煙霧吸入性損傷模型制作成功，效果穩(wěn)定可靠。

肺泡毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞和中性粒細(xì)胞等炎癥細(xì)胞在煙霧吸入性損傷的致傷過程中可釋放TNF-α、IL-6等各種細(xì)胞因子，并有花生四烯酸、蛋白酶等代謝產(chǎn)物產(chǎn)生，形成肺水腫及管型，使肺血管氧含量降低[5]。IL-6和TNF-α是引起肺損傷的重要促炎癥介質(zhì)，通過生成細(xì)胞因子和炎癥趨化因子激活炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，增加內(nèi)皮黏附因子的表達(dá)，促進(jìn)中性粒細(xì)胞對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的黏附[6]。在本實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)血清IL-6及TNF-α含量，間接反映肺組織炎性損傷的程度。在實(shí)驗(yàn)中，按照相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[7]，對(duì)C組采用槲皮素200mg/kg腹腔注射作為實(shí)驗(yàn)劑量，并觀察其肺治療效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，B、C、D組血清TNF-α及IL-6水平較A組顯著升高，而C組較B組TNF-α及IL-6水平降低，D組較C組水平更低。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示了槲皮素能有效緩解吸入性損傷造成的肺損傷，且預(yù)防性用藥效果更好。

本實(shí)驗(yàn)病理切片結(jié)果顯示，致傷后肺泡結(jié)構(gòu)模糊，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，C組肺泡結(jié)構(gòu)較B組清晰，肺毛細(xì)血管管周及肺泡腔內(nèi)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減少，且預(yù)防性給藥病理變化減輕。有研究表明，肺干濕比的變化可反映肺損傷程度的變化[8]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示C組較B組肺干濕比降低，D組又較C組低。所有這些結(jié)果進(jìn)一步證明槲皮素可減輕吸入性損傷引起的肺損傷，且預(yù)防效果顯著。煙霧吸入性損傷后，機(jī)體產(chǎn)生大量的氧自由基，使內(nèi)皮細(xì)胞受損，造成MDA含量增加，SOD的含量劇烈下降。SOD是生理狀態(tài)下體內(nèi)的一種特異性酶，其活性的高低反映了機(jī)體氧自由基的清除能力[9]。因MDA也稱脂質(zhì)過氧化物酶，所以通過檢測(cè)MDA活性來間接反映組織細(xì)胞脂質(zhì)過氧化的嚴(yán)重程度[10]。肺組織中iNOS的過度表達(dá)會(huì)導(dǎo)致NO的過度生成，而過量的NO可刺激巨噬細(xì)胞釋放大量的炎癥介質(zhì)，加重肺組織損傷。通過檢測(cè)iNOS活性反映肺損傷的程度[11]。研究表明，槲皮素具有清除氧自由基和抗過氧化的作用。在本實(shí)驗(yàn)中，C組較B組MDA、iNOS水平降低，SOD水平增高，且D組上述變化更明顯。提示槲皮素可通過清除自由基和抗過氧化減輕吸入性損傷造成的肺損傷，預(yù)防性用藥效果更好。

綜上，槲皮素可通過清除氧自由基和抗過氧化而對(duì)吸入性肺損傷起到一定的預(yù)防治療作用，且預(yù)防用藥效果更好，但是可否用于臨床治療及在具體治療中用藥劑量、濃度，給藥方式等還須進(jìn)一步研究探討。

（本文圖1～4見封三）

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