一株乳酸乳球菌所產(chǎn)細(xì)菌素的生物學(xué)特性

唐春梅，陳俊亮，任廣躍

(1.河北北方學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院，河北 張家口 075000；2.河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南 洛陽 471003)

一株乳酸乳球菌所產(chǎn)細(xì)菌素的生物學(xué)特性

唐春梅1，陳俊亮2，任廣躍2

(1.河北北方學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院，河北 張家口 075000；2.河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南 洛陽 471003)

對(duì)乳酸乳球菌KLDS4.0326所產(chǎn)類細(xì)菌素進(jìn)行分離純化，并對(duì)細(xì)菌素的部分生物學(xué)特性進(jìn)行研究。在排除酸性產(chǎn)物和過氧化氫的干擾后，菌株的無細(xì)胞發(fā)酵上清液對(duì)金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌等革蘭氏陽性細(xì)菌以及大腸桿菌、沙門氏菌等革蘭氏陰性細(xì)菌具有顯著的抑制作用；經(jīng)胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶和蛋白酶K處理后，抑菌活性降低，表明抑菌成分為蛋白類物質(zhì)；該細(xì)菌素具有良好的熱穩(wěn)定性，在酸性條件下抑菌活性穩(wěn)定，并且具有較廣的抑菌譜，能夠抑制多種革蘭氏陽性細(xì)菌和革蘭氏陰性細(xì)菌。

乳酸乳球菌；細(xì)菌素；生物學(xué)特性

乳酸菌能夠產(chǎn)生多種抗菌物質(zhì)，如有機(jī)酸、雙乙酰、丁酮、過氧化氫、抗真菌肽以及細(xì)菌素[1]。細(xì)菌素是某些細(xì)菌在代謝過程中通過核糖體合成機(jī)制產(chǎn)生的一類具有生物活性的蛋白質(zhì)、多肽，這些蛋白復(fù)合物能夠殺死或抑制與其有相同或相似生活環(huán)境的其他微生物[2]。雖然許多革蘭氏陽性細(xì)菌和革蘭氏陰性細(xì)菌也能夠產(chǎn)生細(xì)菌素，但是由于乳酸菌細(xì)菌素可作為天然防腐劑，能抑制食品中腐敗微生物和致病微生物的生長(zhǎng)，所以其在食品產(chǎn)業(yè)具有的潛在應(yīng)用價(jià)值備受關(guān)注。研究[3-4]表明，某些乳酸菌能有效抑制食源性致病菌中的革蘭氏陽性細(xì)菌，如芽孢桿菌屬、李斯特菌屬、葡萄球菌屬以及肉毒梭狀芽胞桿菌屬。此外，一些細(xì)菌素也能夠有效抑制某些革蘭氏陰性細(xì)菌[5-6]。由于乳酸菌細(xì)菌素能夠有效抑制食源性致病菌，以及消費(fèi)者對(duì)更多天然防腐劑的需求，其在食品領(lǐng)域?qū)⒕哂懈鼜V泛的應(yīng)用前景[7-8]。

本實(shí)驗(yàn)首先對(duì)乳酸乳球菌KLDS4.0326產(chǎn)生的細(xì)菌素進(jìn)行分離純化，然后對(duì)細(xì)菌素的生物學(xué)特性如細(xì)菌素的抑菌譜，對(duì)表面活性劑、蛋白酶、pH值和溫度的敏感性等進(jìn)行研究，對(duì)于尋找新型乳酸菌細(xì)菌素具有一定的意義，并為將來開發(fā)新的細(xì)菌素天然防腐劑提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株、培養(yǎng)基與試劑

1.1.1 細(xì)菌素產(chǎn)生菌株

乳酸乳球菌KLDS4.0326來源于內(nèi)蒙古傳統(tǒng)乳制品酸馬奶，分離鑒定后，凍存于乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室工業(yè)微生物菌種保藏中心(KLDS-DICC)。

1.1.2 指示菌菌株

金黃色葡萄球菌(S t a p h y l o c o c c u s a u re u s) ATCC25923、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)NICPBP54002和沙門氏菌(Salmonella)ATCCl4028由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供；大腸桿菌(Escherichia coli)ATCC25922由黑龍江省微生物研究所提供；其他標(biāo)準(zhǔn)菌株由KLDS-DICC提供。

1.1.3 培養(yǎng)基

乳酸乳球菌和腸球菌選擇M17培養(yǎng)基 青島海博生物技術(shù)有限公司；乳桿菌選擇改良MRS培養(yǎng)基、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌選擇TSA-YE培養(yǎng)基、其他指示菌用營(yíng)養(yǎng)肉湯及營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.1.4 試劑

胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、過氧化氫酶美國(guó)Sigma公司；蛋白酶K 日本TaKaRa公司；HCl、NaOH、(NH4)2SO4均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.2 儀器與設(shè)備

SPX-150B生化培養(yǎng)箱 上海智城分析儀器制造有限公司；瑞士比歐KLF2000 3.7L發(fā)酵罐 瑞士比歐生物工程公司；Delta320pH計(jì) 瑞士梅特勒-托利多有限公司；ALPHA 1-4型凍干機(jī) 德國(guó)Marin Christ公司。

1.3 方法

1.3.1 制備無細(xì)胞發(fā)酵上清液

將凍干保存的乳酸乳球菌KLDS4.0326，接種于脫脂乳培養(yǎng)基中，置于30℃培養(yǎng)16h，再以1%的接種量接種于改良MRS培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)至穩(wěn)定期，在4℃、10000hg離心15min，收集上清液，調(diào)pH值至6.5，用0.22μm濾膜過濾上清液，保存于4℃冰箱備用[9-10]。

1.3.2 制備細(xì)菌素粗提液

取1L無細(xì)胞發(fā)酵上清液，用70%飽和度的硫酸銨鹽析，在4℃振蕩過夜，再于4℃、10000hg離心20min，收集沉淀，溶于0.02mol/L的乙酸鈉緩沖液(pH6.5)，所得溶液即為細(xì)菌素粗提液。

1.3.3 排除過氧化氫的干擾

過氧化氫酶溶解在20mol/L的乙酸鹽緩沖液(pH6.5)中配成母液，加入無細(xì)胞發(fā)酵上清液中使過氧化氫酶的終質(zhì)量濃度為5mg/mL，30℃水浴2h后，檢測(cè)過氧化氫酶處理后無細(xì)胞發(fā)酵上清液的抑菌活性，用加入等量乙酸鹽緩沖液的無細(xì)胞發(fā)酵上清液作為對(duì)照。

1.3.4 抑菌活性的檢測(cè)

采用牛津杯雙層瓊脂法[11]：在無菌平皿中傾倒入10mL 2%瓊脂。制備含0.7%瓊脂指示菌培養(yǎng)基，接種體積分?jǐn)?shù)1%過夜培養(yǎng)的指示菌菌液，將10mL含有指示菌的軟瓊脂培養(yǎng)基傾倒在事先倒好的瓊脂培養(yǎng)基上，將預(yù)先滅菌的牛津杯放上，在牛津杯的孔中加入100μL發(fā)酵上清液，在超凈工作臺(tái)上靜置3h，30℃培養(yǎng)48h，若在牛津杯周圍出現(xiàn)抑菌圈，用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈直徑，每種指示菌株做3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。

1.3.5 細(xì)菌素抑菌譜

選取典型的革蘭氏陽性細(xì)菌ü ü乳酸乳球菌、腸球菌、乳桿菌、金黃色葡萄球菌、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌、芽孢桿菌以及革蘭氏陰性細(xì)菌üü大腸桿菌、假單胞菌和沙門氏菌等為指示菌，用細(xì)菌素粗提液進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)。

1.3.6 細(xì)菌素對(duì)pH值敏感性及不同pH值條件下的熱穩(wěn)定性

取3mL無細(xì)胞發(fā)酵上清液，用2.0mol/L的NaOH和HCl溶液調(diào)整pH值至2～10，分別測(cè)其抑菌活性，然后分別在60、80、100、121℃保持20min，冷卻后進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)，用25℃放置20min的處理作為對(duì)照。

1.3.7 細(xì)菌素對(duì)蛋白酶的敏感性

取3mL無細(xì)胞發(fā)酵上清液，并調(diào)節(jié)pH值為以下各種酶的最適pH值。按終質(zhì)量濃度1mg/mL分別加入胃蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶K、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和堿性蛋白酶，在30℃溫育2h，然后將pH值調(diào)至6.5，進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)，用不加蛋白酶的無細(xì)胞發(fā)酵上清液作為對(duì)照。

1.3.8 細(xì)菌素對(duì)表面活性劑的敏感性

取3mL無細(xì)胞發(fā)酵上清液，分別加入SDS、吐溫-20、吐溫-80、EDTA和Triton X-100，使各物質(zhì)的終質(zhì)量濃度達(dá)到1mg/mL，30℃溫育2h，進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)，用不加表面活性劑的無細(xì)胞發(fā)酵上清液作為對(duì)照。

1.3.9 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 排除過氧化氫的干擾

無細(xì)胞發(fā)酵上清液(pH6.5)用過氧化氫酶進(jìn)行處理，以未經(jīng)過氧化氫酶處理的發(fā)酵上清液作為對(duì)照，以金黃色葡萄球菌ATCC25923為指示菌進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵上清液經(jīng)過氧化氫酶處理后，抑菌圈直徑為(13.29f0.14)mm，與作為對(duì)照的發(fā)酵上清液的抑菌圈直徑((13.58f0.26)mm)相比略有下降，表明發(fā)酵上清液中的過氧化氫不是主要的抑菌物質(zhì)，還有其他抑菌物質(zhì)對(duì)指示菌起到抑制作用。

2.2 細(xì)菌素抑菌譜

選取20株有代表性的革蘭氏陽性細(xì)菌和革蘭氏陰性細(xì)菌為指示菌，用細(xì)菌素粗提液進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見圖1和表1。由圖1可知，發(fā)酵上清液中的過氧化氫不是主要的抑菌物質(zhì)，還有其他抑菌物質(zhì)對(duì)指示菌起到抑制作用，從而達(dá)到排除過氧化氫干擾的目的。由表1可知，乳酸乳球菌KLDS4.0326產(chǎn)生的細(xì)菌素對(duì)20株指示菌中的18株有不同程度的抑制作用，其中不僅對(duì)革蘭氏陽性細(xì)菌(金黃色葡萄球菌、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌、枯草芽孢桿菌、糞腸球菌、屎腸球菌)具有較好的抑制作用，還可以抑制革蘭氏陰性細(xì)菌(熒光假單胞菌、大腸桿菌、沙門氏菌等)，表明KLDS4.0326所產(chǎn)細(xì)菌素具有較廣的抑菌譜。

圖 1 無細(xì)胞發(fā)酵上清液對(duì)金黃色葡萄球菌(a)和沙門氏菌(b)的抑制效果Fig.1 Antibacterial activity of the cell-free fermentation supernatant of strain KLDS 4.0326 against Staphylococcus aureusand Salmonella

表 1 乳酸乳球菌KLDS4.0326所產(chǎn)細(xì)菌素的抑菌譜(x±s，n=3)Table 1 Antibacterial activity of bacteriocin produced by strain KLDS4.0326 (x±s，n=3)

2.3 細(xì)菌素對(duì)pH值敏感性及不同pH值條件下的熱穩(wěn)定性

表 2 細(xì)菌素pH值敏感性以及不同pH值條件下的熱穩(wěn)定性Table 2 pH sensitivity and thermal stability of bacteriocin produced by strain KLDS4.0326

將無細(xì)胞發(fā)酵上清液先調(diào)至不同pH值后，測(cè)定其對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制活性，再置于不同溫度下加熱15min后測(cè)其抑菌活性，結(jié)果見表2。可知，乳酸乳球菌KLDS4.0326所產(chǎn)細(xì)菌素在pH2～5條件下抑菌活性較強(qiáng)，隨著pH值升高，抑菌活性逐漸下降。細(xì)菌素在酸性條件下能保持較高的抑菌活性，但是高pH值條件下抑菌活性減弱，可能是由于pH值變化導(dǎo)致細(xì)菌素的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)構(gòu)象發(fā)生改變[12-13]。這與許多乳酸菌所產(chǎn)生細(xì)菌素的特性相似，在低pH值時(shí)抑菌活性較強(qiáng)，在pH值偏中性時(shí)，抑菌活性減弱，此類細(xì)菌素屬于酸性細(xì)菌素[14]。因此，乳酸乳球菌KLDS4.0326所產(chǎn)細(xì)菌素適合作為酸性食品防腐劑。無細(xì)胞發(fā)酵上清液經(jīng)不同溫度處理后，隨著溫度升高，抑菌活性逐漸下降，這是由于高溫導(dǎo)致蛋白質(zhì)或多肽失活，使得細(xì)菌素抑菌活性降低。在pH2～8范圍內(nèi)細(xì)菌素表現(xiàn)出較強(qiáng)的熱穩(wěn)定性，在pH4條件下，經(jīng)121℃處理15min后，其抑菌活性下降7.8%。因此，在巴氏殺菌的條件下細(xì)菌素能保持較高的抑菌活性，使其具有在食品工業(yè)中應(yīng)用的潛力。

2.4 細(xì)菌素對(duì)蛋白酶的敏感性

表 3 不同蛋白酶對(duì)細(xì)菌素抑菌活力的影響Table 3 Effect of different proteases on the antibacterial activity of bacteriocin produced by strain KLDS4.0326

由表3可知，經(jīng)過胃蛋白酶、胰蛋白酶處理后抑菌活性略有下降，說明乳酸乳球菌KLDS4.0326細(xì)菌素能夠?qū)瘘S色葡萄球菌和沙門氏菌產(chǎn)生抑制作用，此外，還可被蛋白酶K、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和堿性蛋白酶部分失活，使抑菌活性下降，結(jié)果表明該細(xì)菌素是一種蛋白類物質(zhì)，由于可被蛋白酶降解而不會(huì)在體內(nèi)殘留，具有較高的安全性。

2.5 細(xì)菌素對(duì)表面活性劑的敏感性

表 4 表面活性劑對(duì)細(xì)菌素抑菌活力的影響Table 4 Effect of different surfactants on the antibacterial activity of bacteriocin produced by strain KLDS4.0326

由表4可知，經(jīng)吐溫-20、吐溫-80、Triton X-100處理后，對(duì)枯草芽孢桿菌和沙門氏菌的抑菌活性無顯著變化(P＞0.05)；但是經(jīng)SDS處理后細(xì)菌素抑菌活性增強(qiáng)。EDTA本身對(duì)金黃色葡萄球菌和沙門氏菌有一定的抑菌作用，因此，無細(xì)胞發(fā)酵上清液與抗菌物質(zhì)同時(shí)使用比單獨(dú)使用時(shí)抑菌效果好。這是因?yàn)橐志镔|(zhì)對(duì)微生物的抑制作用是通過影響細(xì)胞亞結(jié)構(gòu)而實(shí)現(xiàn)的，這些亞結(jié)構(gòu)包括細(xì)胞壁、細(xì)胞膜、與代謝有關(guān)的酶、蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)及遺傳物質(zhì)[15]。因此，抑菌物質(zhì)只要作用于其中的一個(gè)亞結(jié)構(gòu)便能達(dá)到殺菌或抑菌的目的，當(dāng)多種抑菌物質(zhì)協(xié)同作用時(shí)，可產(chǎn)生更佳的抑菌效果。

3 結(jié) 論

乳酸乳球菌KLDS4.0326來源于內(nèi)蒙古傳統(tǒng)乳制品，其產(chǎn)生的細(xì)菌素對(duì)多種革蘭氏陽性細(xì)菌以及革蘭氏陰性細(xì)菌具有較強(qiáng)的抑制作用。在酸性條件下表現(xiàn)出良好的熱穩(wěn)定性；經(jīng)多種蛋白酶處理后，抑菌活性降低，表明抑菌成分為蛋白類物質(zhì)；經(jīng)SDS和EDTA處理后，其抑菌活性顯著增強(qiáng)。因此，乳酸乳球菌KLDS4.0326所產(chǎn)生的細(xì)菌素具有良好的熱、酸穩(wěn)定性和較廣的抗菌譜，在食品保藏劑方面具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

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Biological Characteristics of Bacteriocin Produced by Lactococcus lactis subsp. cremoris

TANG Chun-mei1，CHEN Jun-liang2，REN Guang-yue2
(1. College of Animal Science and Technology, Hebei North University, Zhangjiakou 075000, China；2. College of Food and Bioengineering, Henan University of Science and Technology, Luoyang 471003, China)

A bacteriocin-producing lactic acid bacteria strain was isolated from traditional dairy products in Inner Mongolia, and was identif i ed as Lactococcus. lactis subsp. cremoris KLDS 4.0326. Bacteriocin produced by KLDS 4.0326 was partially purif i ed and its characteristics were also preliminarily studied. The cell-free fermentation supernatant of strain KLDS 4.0326 with the exception of interferences from acidic products and hydrogen peroxide had potent inhibitory effects on both Grampositive bacteria (Staphylococcus aureus and Bacillus subtilis) and Gram-negative bacteria (Escherichia coli and Salmonella). After treatment with trypsin, pepsin, papain or proteinase K, its inhibitory activity decreased, indicating that the antibacterial component was protein. This bacteriocin showed good thermal stability and stable antibacterial activity under acidic conditions, and had a broad antibacterial spectrum against various species of Gram-positive bacteria and Gram-negative bacteria.

Lactococcus lactis；bacteriocin；biological characteristics

TS201.3

A

1002-6630(2013)01-0248-04

2011-09-30

唐春梅(1971ü)，女，副教授，碩士，主要從事動(dòng)物產(chǎn)品研究。E-mail：yanlei199881@163.com