微生物發(fā)酵法制備大豆ACE 抑制肽菌種的篩選

李 響，劉 暢，吳 非*

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030)

微生物發(fā)酵法制備大豆ACE 抑制肽菌種的篩選

李 響，劉 暢，吳 非*

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030)

以大豆分離蛋白為底物，以血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)抑制率和肽含量為檢測指標(biāo)，選擇5株乳酸菌、3株霉菌和1株枯草芽孢桿菌為出發(fā)菌種，通過微生物發(fā)酵篩選出具有高ACE抑制活性的發(fā)酵菌株。結(jié)果表明：乳酸菌中具有強(qiáng)ACE抑制活性的菌株為保加利亞乳桿菌，ACE抑制率和肽含量分別為57.93%和3.27mg/mL；霉菌中具有強(qiáng)ACE抑制活性的菌株為米曲霉，ACE抑制率和肽含量分別為41.23%和2.17mg/mL；枯草芽孢桿菌ACE抑制率和肽含量分別為45.02%和2.25mg/mL。綜合比較9種菌株的發(fā)酵特性，選用保加利亞乳桿菌作為制備大豆抗高血壓活性肽優(yōu)良菌株。

微生物發(fā)酵；ACE抑制肽；大豆蛋白；ACE抑制活性

高血壓是最常見的心血管疾病之一，它能造成大腦、心血管、腎臟的損害，是導(dǎo)致腦卒中、心力衰竭和冠心病等疾病的重要因素[1]。據(jù)報(bào)道，我國有1億多人患有高血壓，每年近100萬人因高血壓而死亡。在大豆血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(angiotensinⅠ-converting enzyme，ACE)抑制肽制備的研究中，主要有酶法和微生物發(fā)酵法兩種。微生物發(fā)酵法主要利用的是發(fā)酵菌株的產(chǎn)酶及酶解能力[2]，目前應(yīng)用較廣的微生物主要有乳酸菌、枯草芽孢桿菌、放線菌、黑曲霉和米曲霉等。與直接酶解法相比，微生物發(fā)酵法成本低廉、工藝過程簡便、條件溫和，得率提高10%～20%，成本卻僅為酶解法的50%～60%[3]。通過微生物作用對某些苦味肽基團(tuán)進(jìn)行修飾和重組，使小肽之間、小肽與氨基酸之間發(fā)生移接、重排。制得的大豆蛋白活性肽(ACEIP)具有溶解性好，無苦味和異味，口感好，受熱不凝固等優(yōu)點(diǎn)[4]，具有良好的應(yīng)用前景和經(jīng)濟(jì)性。近年來，國外有很多關(guān)于發(fā)酵法制備ACEIP的研究，最早Yamamoto等[5]研究得出瑞士乳桿菌發(fā)酵乳的ACE抑制活性和肽含量均高于其他乳酸菌菌株。但是國內(nèi)對于微生物發(fā)酵法制備ACEIP的研究還處于起步階段，且從大豆蛋白中提取ACEIP的研究更少。在制備大豆ACE抑制肽的研究中，菌種的篩選尤為重要。不同的菌種所產(chǎn)的蛋白酶不同，對大豆蛋白的作用位點(diǎn)也不同，導(dǎo)致水解產(chǎn)物的ACE抑制活性差別很大[6]。因此本實(shí)驗(yàn)采用微生物發(fā)酵法，利用大豆分離蛋白為底物，以ACE抑制率和肽含量為檢測指標(biāo)，確定制備大豆ACE抑制肽的最佳菌株，為工業(yè)化生產(chǎn)具有降血壓功能的發(fā)酵產(chǎn)品提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆分離蛋白 國家大豆工程技術(shù)研究中心；嗜熱鏈球菌(Str)、保加利亞乳桿菌(Lb)、黑曲霉、米曲霉、根霉、枯草芽孢桿菌 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院；副干酪乳桿菌(KLDS 1.0201)、乳酸乳球菌乳酸亞種(KLDS 4.0303)和德氏乳桿菌保加利亞亞種(KLDS 1.0205) 教育部國家乳品科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；改良MRS培養(yǎng)基、普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、察氏培養(yǎng)基和土豆汁培養(yǎng)基。

血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)、馬尿酰組氨酰亮氨酸(HHL)、十二烷基磺酸鈉(SDS) 美國Sigma公司；鄰苯二甲醛(OPA)、β-巰基乙醇(化學(xué)純)；乙酸乙酯、鹽酸等(分析純)。

1.2 儀器與設(shè)備

TU-1800型紫外-可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限公司；XW-80A漩渦混合器 上海青浦瀘西儀器廠；立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海迅博實(shí)業(yè)有限公司；pHS-3C型pH計(jì) 上海偉業(yè)儀器廠；高速離心機(jī) 北京醫(yī)用離心機(jī)廠；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；FD5-4型冷凍干燥機(jī) 美國西蒙公司；電熱恒溫水浴鍋 北京市永光明醫(yī)療儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 大豆蛋白溶液的制備

取適量優(yōu)質(zhì)大豆分離蛋白粉，加入水與之混合配成溶液，使其底物質(zhì)量濃度為5g/100mL，pH值自然。然后將配好的溶液進(jìn)行巴氏殺菌，60℃加熱30min。待混合液降溫至25～28℃時(shí)備用。

1.3.2 菌種的活化

將5株乳酸菌菌株的凍存管分別轉(zhuǎn)接到改良MRS液體培養(yǎng)基中，40℃靜置培養(yǎng)16h。將黑曲霉和米曲菌的斜面保藏菌種轉(zhuǎn)接到察氏培養(yǎng)基，根霉接種到土豆汁培養(yǎng)基中，30℃、200hg，振蕩培養(yǎng)48h。將枯草芽孢桿菌的斜面保藏菌種轉(zhuǎn)接到普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，37℃、200hg，振蕩培養(yǎng)24h。

1.3.3 不同菌種的發(fā)酵分析

在無菌操作下，分別將活化好的5株供試乳酸菌、3株霉菌以及枯草芽孢桿菌以體積分?jǐn)?shù)5%的接種量接種于滅菌大豆蛋白溶液中，起始pH值自然。每隔6h取樣離心，取上清液進(jìn)行冷凍干燥，測定其ACE抑制活性，確定最佳發(fā)酵時(shí)間，并觀察不同菌株在發(fā)酵期間ACE抑制率和pH值變化情況。發(fā)酵結(jié)束后測定發(fā)酵液中的肽含量。

1.3.4 具有ACE抑制活性最佳菌株的篩選

根據(jù)9株菌株的發(fā)酵分析結(jié)果，綜合比較不同菌株發(fā)酵液的ACE抑制活性、肽含量以及發(fā)酵時(shí)間，篩選出適合制備ACE抑制肽的最佳菌株。

1.3.5 發(fā)酵液中ACE抑制活性的測定

采用Cushman等[7]的紫外比色法進(jìn)行ACE抑制活性的檢測，并對該方法進(jìn)行了改進(jìn)。用0.1mol/L硼酸鹽緩沖液(含0.3mol/L NaCl，pH8.3)將HHL配成5.0mmol/L的溶液。在 10mL 試管中加入120μL 5.0mmol/L HHL溶液和20μL樣品，于37℃保溫3～5min后，再加入10μL ACE溶液(溶解于蒸餾水中，活力為0.1U/mL)，混勻后在37℃保溫1h，加入150μL 1.0mol/L的鹽酸溶液以終止反應(yīng)，再加入1mL醋酸乙酯，旋渦混合進(jìn)行離心(4000hg，10min)；吸取1.0mL 750μL的醋酸乙酯層，120℃烘箱烘干，加入3.0mL去離子水，漩渦混勻30s后在波長228nm處測定光密度。同樣條件下，以不加樣品為對照組，不加樣品和ACE溶液為空白組做平行實(shí)驗(yàn)。ACE抑制率按下式計(jì)算。

式中：ODb為不加樣品，ACE與HHL完全反應(yīng)的光密度，即對照組；ODa為ACE抑制劑和ACE溶液與HHL同時(shí)反應(yīng)的光密度；ODc為空白組光密度。

1.3.6 發(fā)酵液中肽含量的測定

參考Church等[8]鄰苯二甲醛的方法進(jìn)行測定。取1mL發(fā)酵液加入200μL 0.75mol/L三氯乙酸溶液混勻，6000hg離心5min，取100μL上清液加入2mL OPA試劑，混勻后在340nm波長處測定其光密度，用100μL蒸餾水，加入200μL 0.75mol/L三氯乙酸溶液、6mL OPA試劑混勻作為空白對照。用亮氨酸作為標(biāo)準(zhǔn)品，配制梯度稀釋溶液。取100μL標(biāo)準(zhǔn)品，加入2mL OPA試劑，漩渦混勻后在340nm波長處測定其光密度，繪制肽含量與光密度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線查出對應(yīng)的亮氨酸的質(zhì)量(μg)，計(jì)算樣品溶液中的肽含量。

1.3.7 統(tǒng)計(jì)分析

采用Microsoft Excel(Office 2003)軟件完成，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SAS8.1軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌發(fā)酵大豆蛋白結(jié)果

分別將5株乳酸菌在最佳菌齡時(shí)以5%的接種量接種到大豆蛋白溶液中，37℃條件下發(fā)酵30h，發(fā)酵結(jié)果見圖1、2。5株乳酸菌均具有ACE抑制能力，其中保加利亞乳桿菌的ACE抑制率和肽含量均為最高，分別為57.93%和3.27mg/mL，最佳發(fā)酵時(shí)間為30h。在發(fā)酵初期，菌株的產(chǎn)酸量小，發(fā)酵液中的ACE抑制活性較低，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，發(fā)酵液的pH值下降趨勢明顯。在發(fā)酵12h后，發(fā)酵液逐漸開始凝乳，ACE抑制率明顯增加，原因可能是乳酸菌發(fā)酵凝乳后能夠促進(jìn)ACE抑制肽的釋放，使ACE抑制活性增強(qiáng)[9]。當(dāng)發(fā)酵時(shí)間達(dá)到24h時(shí)，KLDS1.0201、KLDS 1.0205、 KLDS 4.0303和嗜熱鏈球菌的ACE抑制率達(dá)到最大。24～30h，4株乳酸菌的ACE抑制率均有小幅度的降低，此時(shí)pH值降到5.5左右，可能是隨著pH值的降低，酸度上升，乳酸菌的生長受到抑制，菌體活力也下降了[10-11]。但是保加利亞乳桿菌在發(fā)酵24h后、pH值低于5.5時(shí)，仍能緩慢生長，釋放ACE抑制肽，這說明其耐酸性較好，使得ACE抑制率繼續(xù)增加，達(dá)到57.93%，顯著高于其他乳酸菌。

圖 1 乳酸菌發(fā)酵過程中ACE抑制率和pH值的變化Fig.1 Time courses of ACE inhibitory rate and pH during SPI fermentation by different Lactobacillus strains

圖 2 5種乳酸菌ACE抑制率與肽含量的比較Fig.2 Effect of different Lactobacillus strains on ACE inhibitory rate and peptide concentration before and after fermentation

2.2 霉菌發(fā)酵大豆蛋白結(jié)果

分別將3株霉菌在最佳菌齡時(shí)以5%的接種量接種到大豆蛋白溶液中，30℃發(fā)酵48h。由圖3可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的增加，3株霉菌發(fā)酵液的ACE抑制率均呈上升趨勢，在發(fā)酵48h達(dá)到最大，而pH值基本處于穩(wěn)定狀態(tài)，保持在7.1左右，且有先升高后降低的微小趨勢。由圖4可知，米曲霉的ACE抑制率和肽含量最高，分別為41.23%和2.17mg/mL。原因可能是霉菌發(fā)酵產(chǎn)酸性、中性和堿性3種蛋白酶，其中米曲霉以產(chǎn)中性蛋白酶和堿性蛋白酶為主，只產(chǎn)生很少量的酸性蛋白酶[12-13]。隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，微生物分解大豆分離蛋白產(chǎn)生堿(氨或胺類)，導(dǎo)致發(fā)酵液的pH值升高，并適合堿性蛋白酶的作用條件，有利于米曲霉發(fā)酵釋放ACE抑制肽[14]。

圖 3 不同霉菌發(fā)酵過程中ACE抑制率和pH值的變化Fig.3 Time courses of ACE inhibitory rate and pH during SPI fermentation by different mould strains

圖 4 3種霉菌ACE抑制率與肽含量的比較Fig.4 Effect of different mould strains on ACE inhibitory rate and peptide concentration before and after fermentation

2.3 枯草芽孢桿菌發(fā)酵大豆蛋白結(jié)果

圖 5 枯草芽孢桿菌發(fā)酵過程中ACE抑制率、肽含量和pH值的變化Fig.5 Effect of Bacillus subtilis fermentation on ACE inhibitory rate and peptide concentration

將枯草芽孢桿菌在最佳菌齡時(shí)以5%的接種量接種到大豆蛋白溶液中，30℃發(fā)酵40h，發(fā)酵結(jié)果見圖5?？芍?，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，發(fā)酵液中的ACE抑制率呈先上升后降低的趨勢，發(fā)酵30h時(shí)達(dá)到最大，此時(shí)ACE抑制率達(dá)到45.02%。發(fā)酵后測得的肽含量為2.25mg/mL，且發(fā)酵前后發(fā)酵液中肽含量明顯增加。姜瞻梅等[15]研究表明，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，發(fā)酵液pH值呈先下降后增加的趨勢，與本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果一致。在整個(gè)發(fā)酵進(jìn)程中，可能是發(fā)酵初期菌體迅速分解利用葡萄糖，使得產(chǎn)酸大于產(chǎn)堿，導(dǎo)致pH值下降；隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，大豆蛋白開始被利用，菌體代謝中產(chǎn)生更多的是堿性類氮源分解物(如氨等)，從而導(dǎo)致pH值上升。

2.4 具有ACE抑制活性最佳菌株的確定

表 1 9種菌株的篩選結(jié)果Table 1 Results of screening 9 strains for microbial preparation of ACE inhibitory peptides from SPI

由表1可知，乳酸菌KLDS 1.0201、KLDS 1.0205、KLDS 4.0303和嗜熱鏈球菌的最佳發(fā)酵時(shí)間是24h，保加利亞乳桿菌與枯草芽孢桿菌的最佳發(fā)酵時(shí)間是30h，霉菌的最佳發(fā)酵時(shí)間為48h。保加利亞乳桿菌的ACE抑制率和肽含量均較其他菌株高，分別為57.93%和3.27mg/mL，且發(fā)酵時(shí)間相對較短，是制備ACE抑制肽的最佳菌株。還發(fā)現(xiàn)在所有菌株中，ACE抑制率高的菌株其肽含量也較高，可推斷ACE抑制活性與肽含量之間具有一定的正相關(guān)性。

3 結(jié) 論

乳酸菌、霉菌和枯草芽孢桿菌均具有ACE抑制活性，乳酸菌中具有強(qiáng)ACE抑制活性的菌株為保加利亞乳桿菌，ACE抑制率和肽含量分別為57.93%和3.27mg/mL；霉菌中具有強(qiáng)ACE抑制活性的菌株為米曲霉，ACE抑制率和肽含量為41.23%和2.17mg/mL；枯草芽孢桿菌的ACE抑制率和肽含量分別為45.02%和2.25mg/mL。所有菌株中，保加利亞乳桿菌發(fā)酵大豆蛋白結(jié)果測得的ACE抑制活性最高，顯著高于其他菌株，且發(fā)酵時(shí)間較短。在乳酸菌發(fā)酵分析中發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵液具有凝乳特性，且在凝乳后ACE抑制率明顯增加，可推斷乳酸菌發(fā)酵凝乳后能夠促進(jìn)ACE抑制肽的釋放。實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)所有菌株發(fā)酵前后，發(fā)酵液中的肽含量增加，ACE抑制活性也增強(qiáng)，說明ACE抑制活性與肽含量之間具有一定的正相關(guān)性。綜合比較9種菌株的發(fā)酵特性，選用保加利亞乳桿菌作為制備大豆ACE抑制肽的優(yōu)良菌株。

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Screening of Optimal Strain for Microbial Preparation of ACE Inhibitory Peptides from Soybean Protein Isolate

LI Xiang，LIU Chang，WU Fei*
(College of Food Science, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China)

To screen the optimal strain for microbial preparation of ACE inhibitory peptides from soybean protein isolate (SPI), the effects of different strains including 5 Lactobacillus strains, 3 mould strains and 1 Bacillus subtilis strain on ACE inhibitory rate and peptide concentration were investigated. Lactobacillus bulgaricus was found to be the best of five 5 Lactobacillus strains for the preparation of ACE inhibitory peptides from SPI, providing an ACE inhibitory rate of 57.93% and a peptide concentration of 3.27 mg/mL. A. oryzae was the best mould, providing an ACE inhibitory rate of 41.23% and a peptide concentration of 2.17 mg/mL. Bacillus subtilis fermented SPI showed an ACE inhibitory rate of 45.02% and a peptide concentration of 2.25 mg/mL. Comparing the fermentation characteristics of 9 strains, Lactobacillus bulgaricus was an excellent strain for the preparation of ACE inhibitory peptides from SPI.

microbial fermentation；ACE inhibitory peptides；soybean protein；ACE inhibitory activity

TS214.2

A

1002-6630(2013)01-0185-04

2011-10-18

黑龍江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(C200942)

李響(1987ü)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)。E-mail：dream9645@sina.com

*通信作者：吳非(1968ü)，女，教授，博士，研究方向?yàn)榇蠖巩a(chǎn)品精深加工。E-mail：wfneau@163.com