乳酸菌和酵母菌復(fù)合發(fā)酵芹菜汁制備泡菜母液條件的優(yōu)化

張曉，夏延斌

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128）

泡菜是以乳酸菌為主，兼有酵母菌和醋酸菌等發(fā)酵而成的傳統(tǒng)食品。傳統(tǒng)泡菜生產(chǎn)中的自然發(fā)酵受季節(jié)、氣候等因素的影響較大，并存在發(fā)酵周期長(zhǎng)、質(zhì)量不穩(wěn)定等缺陷[1]。為了改善傳統(tǒng)生產(chǎn)方式的不足，許多學(xué)者對(duì)采用純菌種發(fā)酵泡菜進(jìn)行了研究[2–6]。由于純菌種發(fā)酵對(duì)不同原料的適應(yīng)性不強(qiáng)，因此，在生產(chǎn)實(shí)踐中采用菜汁培養(yǎng)發(fā)酵母液，利用發(fā)酵母液再發(fā)酵泡菜。該方法雖然簡(jiǎn)單易行，但需要選擇菌種和菌種組合方式。目前，關(guān)于泡菜的研究主要集中在泡菜中乳酸菌區(qū)系和乳酸菌的分離[7]以及乳酸菌純菌種發(fā)酵，也有學(xué)者對(duì)泡菜中酵母菌進(jìn)行了研究[8]，從發(fā)酵初期泡菜中分離出酵母菌種，如異常漢遜酵母、德氏酵母、羅斯酵母、畢赤氏酵母、魯氏酵母、紅酵母等，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵型酵母對(duì)泡菜的風(fēng)味和成熟度有重要影響。

筆者采用乳酸菌和酵母菌復(fù)合發(fā)酵制備泡菜母液，旨在能將該母液直接加入到蔬菜中進(jìn)行發(fā)酵，使生產(chǎn)出的泡菜產(chǎn)品質(zhì)量均一、穩(wěn)定，實(shí)現(xiàn)泡菜標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

芹菜購(gòu)于湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)；菌種為植物乳 桿 菌 （lactobacillus plantarum）、 短 乳 桿 菌（lactobacillus brevis）和魯氏酵母（saccharomyces rouxii），從發(fā)酵辣椒中分離、篩選得到。

MRS培養(yǎng)基是將蛋白胨10 g、牛肉膏10 g、酵母膏5 g、檸檬酸二銨2 g、葡萄糖10 g、Tween–80 1 mL、K2HPO42 g、MgSO4·7H2O 0.58 g、MnSO4·4H2O 0.25 g、蒸餾水1 L混合后，調(diào)pH至6.2。這種培養(yǎng)基主要用于乳酸菌計(jì)數(shù)、活化、發(fā)酵種子制備。若配制MRS固體培養(yǎng)基，在MRS液體培養(yǎng)基中添加瓊脂20 g。

YPD培養(yǎng)基是由酵母膏10 g、葡萄糖20.0 g、瓊脂20.0 g、蛋白胨2 g、水1 L混合而成，pH自然[9–10]。以上培養(yǎng)基均于121 ℃滅菌20 min。

主要設(shè)備為高壓滅菌鍋、電子天平、紫外無(wú)菌操作臺(tái)、恒溫培養(yǎng)箱、榨汁機(jī)、pH計(jì)、恒溫?fù)u床。

1.2 方 法

1.2.1 菌種活化

將保藏的菌種接入MRS和YPD斜面培養(yǎng)基，分別于37、28 ℃培養(yǎng)至出現(xiàn)菌落后，從斜面上挑取菌苔到另一斜面，重復(fù)2次，得到活化菌種。從活化好的菌種中挑取菌落，接入 MRS液體培養(yǎng)基及YPD液體培養(yǎng)基中，分別于37、28 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h，得到三角瓶液態(tài)培養(yǎng)的純種菌液。

1.2.2 泡菜母液的制備

將新鮮芹菜去除綠葉，清洗，濾干，切成長(zhǎng)2～3 cm的長(zhǎng)條，榨成汁。稱取汁液50 g，加水100 mL，充分混合，用0.1 mol/L氫氧化鈉溶液或0.1 mol/L檸檬酸溶液調(diào)節(jié)pH，在121 ℃條件下滅菌20 min，加入菌液，在恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，即得泡菜母液。統(tǒng)計(jì)乳酸菌數(shù)和酵母菌數(shù)。

1.2.3 發(fā)酵母液培養(yǎng)條件優(yōu)化

1） 單因素試驗(yàn)。在芹菜汁中添加葡萄糖和酵母膏。初始試驗(yàn)條件：pH為6.5；植物乳桿菌、短乳桿菌、魯氏酵母的體積比為2∶2∶1；接種量3%；溫度25 ℃。依次改變碳源、氮源、碳氮源比例、pH、菌種接種量之比、接種量和溫度，分析各因子對(duì)乳酸菌和酵母菌生長(zhǎng)的影響[11–14]，并篩選出較優(yōu)參數(shù)。

2） 正交試驗(yàn)。分別以乳酸菌數(shù)和酵母菌數(shù)作為參考指標(biāo)，根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取主要影響因素及相應(yīng)水平進(jìn)行正交試驗(yàn)，以優(yōu)化發(fā)酵母液培養(yǎng)條件的工藝參數(shù)。

3） 驗(yàn)證試驗(yàn)。采用兩次平行試驗(yàn)，對(duì)正交試驗(yàn)中所得的最優(yōu)組合進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)[15–16]。

1.2.4 指標(biāo)測(cè)定及數(shù)據(jù)處理

乳酸菌與酵母菌總數(shù)參照文獻(xiàn)[17]中的方法進(jìn)行測(cè)定：在MRS固體培養(yǎng)基中添加500 μg/mL的硫酸銅來抑制酵母菌的生長(zhǎng)，采用稀釋平板計(jì)數(shù)法[18]測(cè)定乳酸菌總數(shù)；在酵母菌固體培養(yǎng)基（YPD）中添加500 μg/mL硫酸鏈霉素，排除乳酸菌生長(zhǎng)對(duì)酵母菌總菌數(shù)檢測(cè)的干擾，得到發(fā)酵產(chǎn)品中的酵母菌總數(shù)。

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析采用正交設(shè)計(jì)助手Ⅱ3.1.1軟件進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵母液培養(yǎng)條件優(yōu)化的單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 適宜碳源的選取

由表1可見，蔗糖發(fā)酵母液中菌體的增值略低，這可能與菌體缺乏分解淀粉等大分子碳水化合物的酶系有關(guān)。相對(duì)葡萄糖而言，乳糖對(duì)乳酸菌和酵母菌增殖的促進(jìn)作用更明顯，其菌體數(shù)量也高于空白組，所以，選取乳糖為碳源。

2.1.2 適宜氮源的選取

由表1可以看出，氮源是影響菌落總數(shù)的重要因素，添加氮源發(fā)酵母液中的總菌數(shù)比不添加氮源的明顯要高，且最終pH更低。因?yàn)槿樗峋徒湍妇纸獾鞍踪|(zhì)的能力有限，其增殖速率與汁液中蓄積的游離氨基酸和多肽等物質(zhì)的含量密切相關(guān)。以酵母膏為氮源的泡菜母液中活菌數(shù)比其他氮源的活菌數(shù)多，這可能是酵母膏提供的多肽類和氨基酸能很好地被酵母菌和乳酸菌利用，促進(jìn)菌體生長(zhǎng)，因此，選用酵母膏為氮源。

2.1.3 適宜碳氮比的選取

由表1可知，在碳、氮比中，隨著碳源所占比例的增加，乳酸菌和酵母菌總數(shù)逐漸增多，表明以乳糖和酵母膏為碳源和氮源對(duì)其菌體生長(zhǎng)有很好的促進(jìn)作用，且乳酸菌數(shù)變化比較明顯。當(dāng)碳氮比為4∶1時(shí)，菌落總數(shù)較多。

表1 不同培養(yǎng)條件下發(fā)酵母液中的乳酸菌數(shù)和酵母菌數(shù)Table 1 Influence of different factors on the growth of actic acid bacteria and yeast 108 cfu/mL

2.1.4 適宜培養(yǎng)溫度的選取

由表1可知，隨著溫度升高，發(fā)酵母液中酵母菌總數(shù)先增多，后減少，這是因?yàn)榻湍妇倪m宜生長(zhǎng)溫度為28～30 ℃；當(dāng)溫度高于30 ℃，酵母菌生長(zhǎng)受到抑制。因乳酸菌生長(zhǎng)緩慢，所以乳酸菌數(shù)總體變化不大。綜合考慮乳酸菌與酵母菌的數(shù)量和生產(chǎn)耗能，選取適宜培養(yǎng)溫度為30 ℃。

2.1.5 適宜接種量的選取

由表1可知，不同接種量對(duì)發(fā)酵母液中菌體的高密度培養(yǎng)有一定的影響，當(dāng)接種量為 3%時(shí)，乳酸菌和酵母菌的活菌數(shù)最多；接種量為 5%時(shí)，活菌數(shù)反而減少。這可能由于接種量大，菌體生長(zhǎng)量多，發(fā)酵后期因營(yíng)養(yǎng)缺乏導(dǎo)致部分菌體死亡，因此，選擇適宜接種量為3%。

2.1.6 適宜接種比例的選取

由表1可見，以植物乳桿菌、短乳桿菌、魯氏酵母體積比為3∶3∶1進(jìn)行接種時(shí)，產(chǎn)品中乳酸菌與酵母菌的數(shù)量比例較為合適，符合生產(chǎn)要求；當(dāng)乳酸菌與酵母菌比例過低時(shí)，泡菜母液產(chǎn)品和質(zhì)量受到影響；當(dāng)比例過高時(shí)，酵母菌在泡菜母液中的比例增大。綜合考慮，選取適宜接種比例為3∶3∶1。

2.1.7 適宜起始pH的選取

由表1可見，起始pH值為6.5時(shí)，活菌數(shù)量較多。起始pH值過低或過高都不利于菌體生長(zhǎng)，當(dāng)pH過低時(shí)，由于混合菌在培養(yǎng)過程中產(chǎn)生酸，使得pH值下降較快，影響酵母菌生長(zhǎng)；當(dāng)pH為7.5時(shí)，乳酸菌生長(zhǎng)受到抑制，這是因?yàn)榻湍妇l(fā)酵糖產(chǎn)生甘油影響了乳酸菌生長(zhǎng)。調(diào)節(jié)發(fā)酵母液的pH為6.5，有利于3種菌的協(xié)調(diào)生長(zhǎng)，適宜pH為6.5。

2.2 發(fā)酵母液培養(yǎng)條件優(yōu)化的正交試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)表2正交試驗(yàn)。

表2 正交試驗(yàn)的因素和水平Table 2 Factors and levels of orthogonal test

正交試驗(yàn)結(jié)果及其極差分析（表3）表明，主要考慮乳酸菌生長(zhǎng)情況時(shí)，碳氮比、接種量、pH、培養(yǎng)溫度和接種比例的影響依次減小。各處理間差異較大，最優(yōu)組合為A4B4C4D2E3或A4B3C4D2E3，即碳氮源質(zhì)量比5∶1、培養(yǎng)溫度35或30℃、接種量7%、接種比例為2∶2∶1、pH為6.5。

由表3可見，當(dāng)主要考慮酵母菌生長(zhǎng)情況時(shí)，碳氮比、pH、接種量、培養(yǎng)溫度和接種比例的影響依次減小。最優(yōu)組合為A4B4C4D2E3，即碳氮源質(zhì)量比5∶1、培養(yǎng)溫度35 ℃、接種量7%、接種比例為2∶2∶1、pH為6.5。

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 3 The results of orthogonal test

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

經(jīng)驗(yàn)證，組合 A4B4C4D2E3的乳酸菌活菌數(shù)達(dá)1.84×108cfu/mL，酵母菌活菌數(shù)達(dá)1.24×108cfu/mL。組合 A4B3C4D2E3的乳酸菌活菌數(shù)達(dá) 1.78×108cfu/mL，酵母菌活菌數(shù)達(dá)1.22×108cfu/mL。以上結(jié)果與正交試驗(yàn)中的最佳組合所得乳酸菌數(shù)和酵母菌數(shù)基本持平，因此，從節(jié)約能源的角度考慮，選用碳氮源質(zhì)量比5∶1、培養(yǎng)溫度30 ℃、接種量7%、接種比例 2∶2∶1、pH6.5為發(fā)酵母液的較優(yōu)培養(yǎng)條件。

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，乳糖作為發(fā)酵母液碳源的效果優(yōu)于葡萄糖和蔗糖，酵母膏作為氮源比胰蛋白胨和牛肉膏的效果好。用乳酸菌和酵母菌復(fù)合發(fā)酵芹菜汁制備泡菜母液的較優(yōu)條件為：碳氮比為 5∶1 （乳糖質(zhì)量濃度為20 g/L，酵母膏質(zhì)量濃度為5 g/L）、培養(yǎng)溫度30 ℃、pH6.5、植物乳桿菌、短乳桿菌和魯氏酵母的體積比為2∶2∶1、接種量7%。在該培養(yǎng)條件下，乳酸菌和酵母菌的增殖效果好，乳酸菌活菌數(shù)達(dá) 1.78×108cfu/mL，酵母菌活菌數(shù)達(dá)1.22×108cfu/mL。

采用乳酸菌和酵母菌復(fù)合發(fā)酵芹菜汁制備泡菜母液，可為純種發(fā)酵技術(shù)提供參考。將該泡菜母液直接投入到蔬菜中進(jìn)行發(fā)酵，能減少泡菜生產(chǎn)加工工序。

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英文編輯：王 庫(kù)