替加氟栓質量標準提高研究＊

(重慶市食品藥品檢驗所，重慶 401121)

替加氟為抗腫瘤藥物，作用機理、療效及抗瘤譜與氟尿嘧啶相似，與氟尿嘧啶相比作用持久、吸收良好、毒性較低。替加氟栓臨床上主要用于結腸癌、直腸癌等疾病[1]，國外除日本藥局方第十六改正收載了替加氟原料的質量標準外，其他各國藥典均未收載。經(jīng)試驗研究發(fā)現(xiàn)，替加氟栓現(xiàn)行質量標準中鑒別和含量測定的專屬性不強，不能有效區(qū)分替加氟及其主要雜質氟尿嘧啶，且無有關物質檢查項。在標準提高工作中，筆者著重對上述存在的問題進行了考察，擬訂了高效液相色譜(HPLC)法鑒別和含量測定法，并增加了有關物質檢查法?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

替加氟對照品(批號為100468－200401，中國藥品生物制品檢定所);甲醇、乙腈(色譜純)，試驗用水(超純水);替加氟栓(國內市售品，成都第一制藥有限公司，威海華新藥業(yè)集團有限公司，規(guī)格為每枚 0.5 g，批號為 101001，100701)。

2 方法和結果

2.1 色譜條件

2.2 高效液相色譜鑒別

在含量測定項下記錄的色譜圖(圖1)中，供試品溶液主峰的保留時間應與對照品溶液主峰的保留時間一致。兩批供試品溶液主峰的保留時間均與對照品溶液主峰的保留時間一致。

圖1 高效液相色譜圖

2.3 有關物質檢查

2.3.1 擬訂方法

精密稱取本品適量，加流動相定量稀釋成每1 mL中約含0.2 mg的溶液作為供試品溶液;精密量取適量，用流動相定量稀釋成每1 mL中含2 μg的溶液，作為對照溶液;另取氟尿嘧啶對照品，精密稱定，加流動相溶解并定量稀釋成每1 mL中約含1 μg的溶液，作為對照品溶液。照高效液相色譜法[2]測定，用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以甲醇－乙腈－水(10∶5∶85)為流動相，檢測波長為271 nm，理論板數(shù)按替加氟峰計算不低于1 500，替加氟峰與相鄰雜質峰的分離度應符合要求。取對照溶液20 μL注入液相色譜儀，調節(jié)檢測靈敏度，使主成分色譜峰的峰高約為滿量程的10%;再精密量取供試品溶液、對照溶液與對照品溶液各20 μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖至主峰保留時間的2倍。供試品溶液色譜圖中，如出現(xiàn)與對照品溶液色譜圖中氟尿嘧啶保留時間一致的峰，按外標法以峰面積計算，其含量不得大于標示量的0.5%，其他各雜質峰面積之和不得大于對照溶液主峰面積的 0.5 倍(0.5%)。

2.3.2 檢測波長選擇

在該色譜條件下，替加氟與氟尿嘧啶在271 nm波長處均有吸收，故選擇271 nm作為檢測波長。

2.3.3 專屬性試驗

酸破壞:取批號為101001的樣品約72 mg，置100 mL容量瓶中，加1 mol/L鹽酸溶液5 mL，置80℃水浴中加熱10 min，冷卻，加1 mol/L氫氧化鈉溶液5 mL，加流動相稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。

堿破壞:取批號為101001的樣品約72 mg，置100 mL容量瓶中，加1 mol/L氫氧化鈉溶液5 mL，置80℃水浴中加熱10 min，冷卻，加1 mol/L鹽酸溶液5 mL，加流動相稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。

氧化破壞:取批號為101001的樣品約72 mg，置100 mL容量瓶中，加30%過氧化氫溶液，置80℃水浴中加熱10 min，冷卻，加流動相稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。

高溫破壞:取批號為101001的樣品約72 mg，置100 mL容量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，置80℃水浴中放置半小時，冷卻，作為供試品溶液。

1若寶寶燙傷較嚴重，除去衣服時，已有明顯的紅色滲水的創(chuàng)面（表皮已燙掉）就不要再用水沖洗，以免感染；也不要把冰塊直接放在傷口上降溫，以免皮膚組織凍傷。應用慶大霉素加生理鹽水擦拭患處，用紗布嚴密包裹后，立即送醫(yī)院進行治療。

光破壞:取批號為101001的樣品約72mg，置100mL容量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，置日光下放置72h，作為供試品溶液。

取上述破壞后的供試品溶液，照擬訂的色譜條件進樣分析，記錄色譜圖(見圖2)。可見，樣品經(jīng)破壞后產(chǎn)生的降解產(chǎn)物均能與替加氟和氟尿嘧啶峰有效分離，用二極管陣列檢測器在200～400 nm波長范圍內掃描，替加氟和氟尿嘧啶的純度均符合要求，說明擬訂的色譜條件可用于測定替加氟片的有關物質。

圖2 破壞試驗高效液相色譜圖

2.3.4 方法學考察

線性關系考察:取替加氟對照品適量，用流動相溶解并稀釋制成系列質量濃度的對照溶液，進樣20 μL測定?；貧w方程為A=50.062 C+9.217 8，r=1.000(n=5)。結果表明替加氟質量濃度在 5.92 ～47.36 μg/mL 范圍內線性關系良好。

系統(tǒng)耐用性試驗:分別用菲羅門、安捷倫公司等不同品牌的色譜柱及Agilent 1100型、Waters 2695型不同型號的色譜儀，按擬訂的條件試驗。檢驗結果基本一致，說明方法的耐用性較好。

加樣回收試驗:精密稱取氟尿嘧啶對照品0.01149g，置100mL容量瓶中，用流動相溶解并稀釋至刻度，精密量取20 mL，加流動相稀釋至100 mL，搖勻，即得加樣對照品貯備液。精密稱取同一批樣品(成都第一制藥有限公司)20 mg，置100 mL容量瓶中，共9份，分別精密加入加樣對照品貯備液4，5，6 mL(各3份)，加甲流動相稀釋至刻度，用流動相稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液。按擬訂的色譜條件測定，計算回收率。結果見表1。

表1 氟尿嘧啶加樣回收試驗結果(n=9)

2.3.5 樣品檢測結果

樣品有關物質測定結果見表2?？梢?，兩批樣品中氟尿嘧啶雜質含量小于標示量的0.5%，其他雜質峰面積總和低于規(guī)定的限度。因此，將替加氟栓的有關物質限度規(guī)定為氟尿嘧啶雜質含量不得過0.5%，總雜質不得過0.5%。

表2 樣品有關物質及含量測定結果

2.4 含量測定

2.4.1 擬訂方法

含量測定:照高效液相色譜法(附錄V D)測定[2]。

色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗:用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以甲醇－乙腈－水(10∶5∶85)為流動相，檢測波長為271 nm。理論板數(shù)按替加氟計算不低于1 500，替加氟峰與相鄰雜質峰的分離度應符合要求。

測定法:取本品10粒，精密稱定適量(約相當于替加氟50 mg)，置50 mL量瓶中，加流動相適量，溫熱，振搖使替加氟溶解，冷卻，用流動相稀釋至刻度，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液適量，用流動相定量稀釋成每1 mL中約含20 μg的供試品溶液，精密量取20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖;另取替加氟對照品，精密稱定，加流動相溶解并定量稀釋制成每1 mL約含20 μg的對照品溶液，同法測定。按外標法以峰面積計算，即得。

2.4.2 方法學考察

重復性試驗:取批號為101001的樣品，精密量取6份，照擬訂的方法測定。結果替加氟含量分別為標示量的 95.7%，94.2% ，94.3% ，95.8% ，95.6% ，95.6% ，平均 95.2% ，RSD=0.78%(n=6)，表明方法重現(xiàn)性好。

精密度試驗:取同一對照品溶液，連續(xù)進樣6針。結果替加氟峰面積分別為 1 216，1 214，1 214，1 225，1 210，RSD=0.46%(n=6)，表明儀器精密度良好。

定量限及檢測限確定:精密稱取替加氟對照品0.010 93 g，置50 mL容量瓶中，加流動相溶解后，并稀釋至刻度，搖勻，精密量取5 mL，置50 mL容量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻;精密量取5 mL，置50 mL容量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻;精密量取1 μL 進樣。結果檢測限為 0.001 μg/mL，定量限為 0.004 μg/mL。

線性關系考察:同有關物質檢查項。

穩(wěn)定性試驗:取同一供試品溶液，分別于配制后 0，1，2，4，6，8 h時依法進樣。結果替加氟峰面積分別為1 216，1 207，1 201，1 198，1 199，1 188，RSD=0.78%(n=6)，表明供試品溶液在 8 h內基本穩(wěn)定。

加樣回收試驗:精密稱取替加氟對照品0.195 0 g，置100 mL容量瓶中，用流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得加樣對照品貯備液。精密稱取樣品10 mg，置50 mL容量瓶中(共9份)，分別精密加入加樣對照品貯備液4，5，6 mL(各3份)，加流動相稀釋至刻度，搖勻，再精密量取5 mL，置100 mL容量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液。精密稱取替加氟對照品0.011 84 g，置50 mL容量瓶中，用流動相溶解并稀釋至刻度，精密量取5 mL，置50 mL容量瓶中，加上述溶劑稀釋至刻度，搖勻，即得對照品溶液。精密量取上述供試品溶液、對照品溶液各20μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖，計算回收率。結果見表3。

2.4.3 樣品含量測定

按擬訂的含量測定方法測定樣品含量，并與現(xiàn)行質量標準中紫外分光光度(UV)法測定結果進行比較。結果見表2。根據(jù)樣品實際測定結果，含量限度仍定為“本品含替加氟(C8H9FN2O3)應為標示量的 90.0% ～110.0%”。

表3 替加氟含量測定加樣回收試驗結果(n=9)

3 討論

替加氟栓現(xiàn)行質量標準中無有關物質檢查項，鑒別和含量測定均采用UV法。由于替加氟與其主要雜質氟脲嘧啶紫外光譜相似，UV法不能有效控制產(chǎn)品質量，而采用高效液相色譜法能有效分離并測定氟脲嘧啶和其他有關物質。

現(xiàn)行質量標準用UV法測定替加氟含量時，栓劑基質和氟尿嘧啶會對測定結果有影響。HPLC法能將替加氟與基質、雜質峰有效分離，測定結果更準確、可靠。

[1]WS－10001－(HD－0162)－2002，國家藥品標準·化學藥品地方標準上升國家標準(第二冊)[S].

[2]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(二部)[M].北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:附錄ⅤD.