Graves病治療前后CD3-CD56+的變化及臨床意義

梁金明，陳聰，許琳，李青，歐志蓮，劉永鵬

(廣東醫(yī)學(xué)院附屬湛江中心醫(yī)院，廣東湛江524037)

Graves病治療前后CD3-CD56+的變化及臨床意義

梁金明，陳聰，許琳，李青，歐志蓮，劉永鵬

(廣東醫(yī)學(xué)院附屬湛江中心醫(yī)院，廣東湛江524037)

目的檢測CD3-CD56+在Graves病治療前后變化，探討NK細(xì)胞在治療過程中的變化及ADCC效應(yīng)對Graves的影響或作用。方法選取正常對照組22例，Graves病初次發(fā)現(xiàn)且未治療病人33例，抗甲狀腺藥物(ATD)治療后緩解患者30例，完全緩解患者12例，及復(fù)發(fā)患者11例，用流式細(xì)胞術(shù)檢測CD3-CD56+的比值。結(jié)果正常對照組結(jié)果為7.03±3.91，初發(fā)組結(jié)果為4.83±2.72，緩解組結(jié)果為5.12±3.19，完全緩解組結(jié)果為7.91±4.05，復(fù)發(fā)組結(jié)果為6.97±3.28；初發(fā)組及緩解組結(jié)果低于正常對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.018，P=0.043)，初發(fā)組結(jié)果明顯高于完全緩解組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.007)；緩解組結(jié)果低于完全緩解組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.016)。結(jié)論Graves病CD3-CD56+低于正常，ADCC效應(yīng)及NK細(xì)胞的其他免疫功能有可能受到損害或限制，破壞體內(nèi)的免疫平衡或免疫功能紊亂。CD3-CD56+結(jié)果對Graves各階段病程的診斷、治療及預(yù)后有臨床意義。

Graves??；白細(xì)胞抗原分化群CD3-CD56+;自然殺傷細(xì)胞;抗體依賴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用;流式細(xì)胞術(shù)

Graves病(Graves’disease，GD)是一種常見內(nèi)分泌異常疾病，與自身免疫性有關(guān)，屬Ⅱ型超敏反應(yīng)，引起這種自身免疫反應(yīng)的因素還不清楚，其機(jī)制之一為NK細(xì)胞介導(dǎo)的ADCC效應(yīng)，而NK細(xì)胞的表面標(biāo)志主要是CD56+及CD16+，有研究表明NK細(xì)胞與甲狀腺細(xì)胞內(nèi)分泌的自身抗體有關(guān)[1]，Graves的病因和復(fù)發(fā)因素尚未完全清楚，國外對Graves病的治療主要以[3]I為主，國內(nèi)對Graves病治療以ATD較多，但復(fù)發(fā)率高，給患者造成極大的精神負(fù)擔(dān)和嚴(yán)重影響生活質(zhì)量，而粵西等沿海地區(qū)是Graves病的高發(fā)區(qū)，本研究通檢測正常人群、Graves病初發(fā)、緩解、完全緩解及復(fù)發(fā)患者CD3-CD56+占淋巴細(xì)胞比值變化，探討Graves病程不同階段的NK細(xì)胞變化及ADCC效應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本收集與處理在健康體檢者中隨機(jī)選擇22例作正常對照組(簡稱正常組)，根據(jù)《內(nèi)科學(xué)》第6版[2]Graves診斷標(biāo)準(zhǔn)分初次發(fā)現(xiàn)且未治療病人33例(簡稱初發(fā)組)，抗甲狀腺藥物(ATD)治療后緩解患者30例(TSH、TT3、TT4結(jié)果比治療前有好轉(zhuǎn)，簡稱緩解組)，完全緩解患者12例(TSH、TT3、TT4結(jié)果完全正常，簡稱完全緩解組)及復(fù)發(fā)患者11例(TSH、TT3、TT4正常后再出現(xiàn)符合Graves結(jié)果，簡稱復(fù)發(fā)組)，其中男性39例，女性69例，年齡11～80歲。抽血2ml用EDTA-K2抗凝全血，用流式細(xì)胞術(shù)檢測CD3-CD56+占淋巴細(xì)胞比值。

1.2 儀器及試劑

1.2.1 儀器美國貝克曼庫爾特公司FC500流式細(xì)胞儀。

1.2.2 試劑CD3-CD56+試劑使用美國貝克曼庫爾特公司生產(chǎn)TETRACHROME 45/56/19/3四色試劑盒。

1.3 方法按試劑盒說明及儀器要求操作：緩慢混勻全血后取100μl加入流式儀專用試管中；吸取45/56/19/3四色試劑10μl加入混勻放室溫避光孵育15min；加500μl Optilyse C溶血素后放室溫避光10min；加500μl BPS室溫避光10min；1500r/ min離心5min，棄上清液；加1ml PBS懸浮細(xì)胞上機(jī)檢測。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析用SPSS17.0軟件對各組CD3-CD56+淋巴細(xì)胞百分比進(jìn)行正態(tài)分布及方差分析(student Newman Keuls test)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

正常對組CD3-CD56+結(jié)果為7.03±3.91，初發(fā)組結(jié)果為4.83±2.72，緩解組結(jié)果為5.12±3.19，完全緩解組結(jié)果為7.91±4.05，復(fù)發(fā)組結(jié)果為6.97± 3.28，初發(fā)組與緩解組低于正常對照組及完全緩解組，正常組、完全緩解組及復(fù)發(fā)組結(jié)果差異不顯著；正常對照組與初發(fā)組、緩解組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＝0.018，P＝0.043)；初發(fā)組與正常對照組、完全緩解組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＝0.018，P＝0.007)；緩解組與正常組、完全緩解組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＝0.043，P＝0.016)；完全緩解組與初發(fā)組、緩解組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＝0.007，P＝0.016)。

表1 各組別CD3-CD56+平均數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)差及正態(tài)檢驗(yàn)

表2 方差分析(student Newman Keuls test)P值表

3 討論

人自然殺傷細(xì)胞(natural killer cells,NK)是機(jī)體免疫系統(tǒng)的重要組成部分，是機(jī)體天然免疫系統(tǒng)的主要細(xì)胞，產(chǎn)生細(xì)胞毒性或分泌細(xì)胞因子，在殺傷腫瘤細(xì)胞和病毒感染細(xì)胞及免疫調(diào)節(jié)中、免疫應(yīng)答中發(fā)揮的重要作用，有學(xué)者報(bào)道NK樣細(xì)胞在免疫功能及腫瘤治療預(yù)后判斷的標(biāo)志指標(biāo)之一[3]。NK細(xì)胞亞群表型和生物學(xué)特征及NK細(xì)胞受體的識(shí)別的多樣性也有大量研究[4,5]。NK細(xì)胞識(shí)別正常組織細(xì)胞和變異細(xì)胞功能主要受其表面多種活化或抑制性受體調(diào)節(jié)的研究具有重要意義[6]，NK細(xì)胞的表型主要表達(dá)CD56+和CD16+而不表達(dá)CD3-，可將NK細(xì)胞分為CD56hi和CD56lo亞群，并在免疫應(yīng)答的過程中發(fā)揮著不同的生物學(xué)功能。NK細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞和被病毒感染的靶細(xì)胞,機(jī)制主要是通過Fas(CD95)和FasL(CD95L)的相互作用、TNF和TNF受體的結(jié)合以及釋放顆粒酶和穿孔素破壞靶細(xì)胞。在NK細(xì)胞與靶細(xì)胞共孵育時(shí),可檢測到TNF2α的釋放,一般認(rèn)為TNF2α是由CD56hi細(xì)胞所分泌[7]。Mysliwiec等[8]研究結(jié)果顯示GD病變傾向于Th2型反應(yīng)或Th1/Th2比例不平衡有關(guān)[9]。Giordano等[10]認(rèn)為,IL21β介導(dǎo)的Fas表達(dá)在喬本甲狀腺炎細(xì)胞的凋亡中起重要作用,同時(shí)Fas介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡可能是喬本甲狀腺炎組織破壞的主要病理機(jī)制。同時(shí),細(xì)胞因子可以調(diào)節(jié)甲狀腺細(xì)胞的增殖，IFN2γ、TNF2α和IL21α可以影響TSH介導(dǎo)的細(xì)胞增殖效應(yīng)。細(xì)胞因子不僅可以直接影響機(jī)體免疫細(xì)胞的活性,而且還可以通過影響甲狀腺細(xì)胞免疫相關(guān)分子的表達(dá)調(diào)節(jié)AITD的病程。

ADCC的殺傷機(jī)制是通過Fas與FasL起作用的，用活化的NK細(xì)胞表面可表達(dá)FasL,當(dāng)NK細(xì)胞表達(dá)的FasL與靶細(xì)胞表面的相應(yīng)受體Fas(CD 94)結(jié)合后形成Fas三聚體,使其胞漿內(nèi)的結(jié)構(gòu)域相聚成簇并與Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白(FADD)結(jié)合,激活caspase-8,通過級聯(lián)反應(yīng)最終導(dǎo)致靶細(xì)胞死亡。還可以通過TNF-α與TNFR-I作用途徑最終使細(xì)胞死亡。NK細(xì)胞受體有幾十種，通過與配體以特定的模式結(jié)合，活化或抑制效應(yīng)調(diào)節(jié)NK細(xì)胞功能。抑制性受體特異性識(shí)別MHCⅠ類分子,抑制NK細(xì)胞的殺傷活性和其他效應(yīng)功能,而活化性受體可被缺乏MHCⅠ類分子的靶細(xì)胞激活,當(dāng)這些活化性受體被相應(yīng)抗體封閉時(shí),NK細(xì)胞殺傷功能降低。

表1及表2結(jié)果顯示初發(fā)組及緩解組CD3-CD56+百分比值均低于正常對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，完全緩解組與正常對照組CD3-CD56+百分比值結(jié)果差異沒統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，初發(fā)組與完全緩解組CD3-CD56+百分比值差別也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說明有Graves病發(fā)生時(shí)CD3-CD56+百分比降低，NK細(xì)胞低于正常，ADCC效應(yīng)及NK細(xì)胞的其他免疫功能都有可能受到損害或限制，破壞體內(nèi)的免疫平衡或免疫功能紊亂。當(dāng)Graves病得到完全緩解時(shí)，CD3-CD56+百分比值回復(fù)正常，說明ADCC的作用及NK細(xì)胞的功能也回復(fù)到正常水平。

從表中結(jié)果可以看出，緩解及完全緩解時(shí)CD3-CD56+百分比值是有差別且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的。緩解時(shí)CD3-CD56+百分比值還是低于正常，ADCC效應(yīng)或NK細(xì)胞免疫功能還有部分受損或未完全正常，只有完全緩解時(shí)，NK細(xì)胞免疫功能才完全正常。CD3-CD56+結(jié)果對Graves各階段病程的診斷、治療及預(yù)后有臨床意義。

復(fù)發(fā)組CD3-CD56+百分比值低于正常對照組及完全緩解組，又高于初發(fā)組及緩解組，也符合上述NK細(xì)胞免疫功能在Graves各病程中的臨床意義，能差別沒統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，很有可能通過治療后，免疫功能產(chǎn)生耐受或紊亂所致。

有研究提示NK細(xì)胞具有免疫記憶功能，通過胚系基因編碼的抑制性受體和活化性受體來識(shí)別MHC I類分子及類樣分子，經(jīng)過初次活化后具有記憶性免疫細(xì)胞的特征[11]。這也許就是Graves在緩解、完全緩解及復(fù)發(fā)中CD3-CD56+結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的原因，從而可以通過CD3-CD56+結(jié)果來指導(dǎo)臨床治療的輔助依據(jù)。同時(shí)，在治療中增強(qiáng)免疫力[12]或調(diào)節(jié)免疫是否可以令Graves能更快更有效治愈及預(yù)防復(fù)發(fā)有臨床意義。

而對于Graves病的免疫機(jī)制、NK細(xì)胞的作用及ADCC效應(yīng)的影響有待進(jìn)一步的研究，如NK細(xì)胞表型、生物學(xué)活性、分泌因子等，ADCC活性測定等，這些對Graves病中的免疫作用或治療、預(yù)防復(fù)發(fā)可能都有臨床意義。

僅這些理論是不夠的，隨著NK細(xì)胞免疫功能研究的不斷發(fā)展[13]、ADCC效應(yīng)及NK細(xì)胞活性測定這些研究有待進(jìn)一步深入，對Graves病的發(fā)病機(jī)制、免疫功能的的關(guān)系及Graves病的治療和預(yù)防復(fù)發(fā)提供科學(xué)的依據(jù)。

[1]Artur B,Mlroslawa U,Anna SB.Analysis of Circulating Tγ/δLymphocytes and CD16 56cell populations in Children and Adolescents with Graves’Disease[J].Pediatr Res 2003,54:425.

[2]葉任高,陸再英,謝毅,等.內(nèi)科學(xué)[M].第6版.北京:人民衛(wèi)生出版社,2004:725-741.

[3]黃祺琦,黃先豹,陳國安,等.CD3+CD56+NKT樣細(xì)胞在急性白血病患者體內(nèi)表達(dá)的研究[J].實(shí)驗(yàn)與檢驗(yàn)醫(yī)學(xué),2010，(28)2：120-122、126.

[4]李子濤，楊濱燕，吳長有，等．人外周血NKT細(xì)胞亞群表型及生物學(xué)特征[J]．中國免疫學(xué)雜志，2011，2(27)：110-114．

[5]田志剛,魏海明.NK細(xì)胞受體識(shí)別的多樣性[J].中國免疫學(xué)雜志, 2004,1(20)：33-35．

[6]Hoglund P，Bredin P．Current perspectives of natural killer cell education by MHC class I molecules[J].Nat Rev Immunol．2010,10 (10)：724-734．

[7]Jacobs R,Hintzen G,KemperA et al.CD56brightcells differ in their KIR repertoire and cytotoxic features from CD56dim NK cells[J]. Eur J Immunol,2001;31:3121-3127.

[8]Mysliwiec J,Kretowski A,Topolska J,et al.Serum Th1 and Th2 profilecytokinelevelchangesinpatientwithGraves’ophthalmopathy treated with corticosteroids[J].Horm Metab Res, 2001,33(12):739-743.

[9]Kocjan T,Wraber B,Repnik U,et al.Changes in Th1/Th2 cytokine balance in Graves,desease[J].Pflügers Arch Eur J Physiol,2000, 440[Suppl]:94-95.

[10]Giordano C,Stassi G,Maria RD,et al.Potential involvement of Fas and its ligand in the pathogensis of Hashimoto′s thyroiditis[J] .Science,1997,275(5302):960-963.

[11]Sun JC，Beilke JN.Lanier LL．Adaptive immune features of natural killer cells[J]．Nature,2009,457(7229):557-561．

[12]楊凌輝,藍(lán)新英.聯(lián)合應(yīng)用氨甲蝶呤治療Graves病臨床觀察[J].海軍醫(yī)學(xué)雜志,2003,24(3):228-229．

[13]Krueger PD，Lassen MG，Qiao H，et al．Regulation of NK cell repertoire and function in the liver[J]．Crit Bey Inununol,2011,3l (1)：43-52．

The changes and clinical significance of CD3-CD56+in Graves disease before and after treatment

LIAN Jinming，CHEN Cong，XU Lin，et al.Zhanjiang Central Hospital Affiliated to Guangdong Medical College,Guangdong Zhanjiang 524037,China

Objective To detect the changes of CD3-CD56+in Graves disease before and after treatment,study the changes of NK cells during treatment and explore the influence or effect of ADCC on Graves disease．Methods Taking 22 cases of health people as control group，33 cases of untreated GD patients，30 cases of after ATD treatment and remission patients，12 cases of complete remission patients and 11 cases of relapse patients as experimental group,we detected the ratio of CD3-CD56+in all subjects by flow cytometry.Results The results of CD3-CD56+in the health control group，untreated GD patients group，after ATD treatment and remission patients group，complete remission patients group and relapse patients group were 7.03±3.91,4.83±2.72, 5.12±3.19,7.91±4.05,6.97±3.28 respectively.The results of CD3-CD56+in the untreated GD patients group and after ATD treatment and remission patients group were lower than those of the health control group.Differences had statistical significance(P= 0.018，P=0.043).The result of CD3-CD56+in the untreated GD patients group was apparently higher than that of the complete remission patients group.Differences had statistical significance(P=0.007).The result of CD3-CD56+in the remission patientss group was lower than that of the complete remission patients group.Differences had statistical significance(P=0.016)．Conclusions The CD3-CD56+of GD is lower than that of normal people，ADCC and the immunolongic function of NK cells are likely to be injured or limited,the body's immune balance is disturbed and the immune function is disorder.The results of CD3-CD56+have the clinical significance in the diagnosis,treatment and prognosis of different stages of Graves Disease.

Graves'Disease；CD3-CD56+；Natural Killer Cells；ADCC；Flow Cytometry

R392．6,R593.2,R581.1

A

1674-1129(2013)03-0220-03

10.3969/j.issn.1674-1129.2013.03.007

湛江市科技攻關(guān)項(xiàng)目編號(hào)：2010C3105008

梁金明，男，39歲，本科，副主任技師，主要從事免疫醫(yī)學(xué)檢測。