甘藍(lán)無蠟粉突變體葉表皮蠟質(zhì)超微結(jié)構(gòu)觀察

牟香麗 王 超 王 帥

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150030）

植物能夠適應(yīng)外界環(huán)境的變化并能生存下來的一個(gè)重要機(jī)制是能夠分泌蠟質(zhì)到角質(zhì)層表面或者角質(zhì)層內(nèi)，充當(dāng)阻擋紫外輻射及病蟲侵害的第一道屏障（Kunst & Samuels，2003）。蠟質(zhì)存在于植物的木栓層、受傷的組織（Hamiton，1995）、花粉、種皮等組織器官中（Preuss et al.，1993）。近年來，與植物表皮蠟質(zhì)相關(guān)的研究越來越多，已經(jīng)從小麥（Muria & Taira，1999）、擬南芥（Broun et al.，2004）、水稻（周小云，2006）、小鹽芥（趙寶，2007）等植物中克隆了一些與蠟質(zhì)相關(guān)的基因，這為闡明蠟質(zhì)組分的生理生化作用及其分子機(jī)制打下了基礎(chǔ)。

結(jié)球甘藍(lán)（Brassica oleraceaL.var.capitataL.）是世界上許多國家的主要蔬菜作物，其表面都披有不同程度的蠟粉霜，葉色呈粉藍(lán)色或藍(lán)綠色；而無蠟粉的亮葉型結(jié)球甘藍(lán)突變體整個(gè)株體表面無蠟粉覆蓋，顏色油亮，葉脈呈黃綠色或綠色，整株光澤度和綠色度都要高于野生型。經(jīng)過多年的選培工作，該突變性狀已能穩(wěn)定遺傳，為了區(qū)別原來的普通甘藍(lán)，稱此類型甘藍(lán)為亮葉甘藍(lán)。據(jù)初蓮香和王余文（1993）報(bào)道，亮葉甘藍(lán)質(zhì)地脆嫩，葉片薄，有光澤，富含糖、VC 及干物質(zhì)等營養(yǎng)成分。亮葉甘藍(lán)還具有一定的抗蟲性，Stoner（1990）研究認(rèn)為，在無蠟粉甘藍(lán)上，甘藍(lán)蚜的種群數(shù)量比正常甘藍(lán)植株低1/10，小菜蛾幼蟲的數(shù)量是正常植株的1/10；Lin等（1984）發(fā)現(xiàn)無蠟粉甘藍(lán)能影響初孵小菜蛾的產(chǎn)卵、取食等行為，而且1 齡幼蟲在無蠟粉甘藍(lán)上的成活率不到正常植株的10%。因此，對(duì)于甘藍(lán)無蠟粉突變體的研究具有十分重要的意義。

關(guān)于植物葉表蠟粉突變體的報(bào)道甚多，蠟質(zhì)基因一直被研究者所關(guān)注，但對(duì)蠟質(zhì)突變體超顯微水平的研究甚少，實(shí)際上對(duì)蠟質(zhì)突變體超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察對(duì)于了解蠟質(zhì)突變情況及探索蠟質(zhì)發(fā)育意義重大。本試驗(yàn)以突變型亮葉甘藍(lán)和野生型結(jié)球甘藍(lán)為試材，對(duì)甘藍(lán)葉片發(fā)育過程中表皮最外層蠟質(zhì)發(fā)育及突變情況進(jìn)行系統(tǒng)地觀察，以期在超顯微水平上了解甘藍(lán)無蠟粉突變體。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為蠟質(zhì)缺失突變型甘藍(lán)材料亮葉98-1030 和蠟質(zhì)正常的野生型甘藍(lán)材料98-1030，均由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院甘藍(lán)課題組提供和保存。98-1030 為早熟甘藍(lán)品種迎春自交得到，早熟，圓球形，蠟粉正常；2007年，在以98-1030 為試驗(yàn)材料進(jìn)行組織培養(yǎng)試驗(yàn)時(shí)，發(fā)現(xiàn)無蠟粉突變體，顏色油亮，無蠟粉，并命名為亮葉98-1030。

試驗(yàn)于2012年春在本院園藝站和農(nóng)場進(jìn)行。將98-1030 和亮葉98-1030 播種于園藝站溫室，并于四葉一心時(shí)移栽于農(nóng)場大田。

1.2 方法

自甘藍(lán)幼苗出土開始，在一葉苗期、三葉苗期、結(jié)球前期、結(jié)球后期及成熟期分別取樣。在苗期選取新生幼葉為材料，在結(jié)球期和成熟期選取最內(nèi)層外葉為材料。

掃描電鏡樣品制作：分別將新鮮葉片沖洗干凈，避開葉脈切成5 mm×10 mm 的長方形小塊，寫好編號(hào)，四氧化鋨熏蒸48 h，晾干3 d，E-1010（HITACHI）型離子濺射鍍膜儀鍍金膜，置于S-3400N（Hitachi）型掃描電子顯微鏡下進(jìn)行觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 一葉苗期甘藍(lán)葉表皮蠟質(zhì)超微結(jié)構(gòu)

甘藍(lán)種子出苗后，第1片真葉剛剛展開時(shí)，從外觀上看，甘藍(lán)蠟質(zhì)突變型與野生型的子葉光滑度和綠色度沒有明顯區(qū)別；第1片真葉在綠色度和光滑度上也差別不顯著。

分別將突變型和野生型的甘藍(lán)幼苗子葉和真葉置于掃描電子顯微鏡下。結(jié)果表明（圖1）：兩者的子葉表皮蠟質(zhì)差異極顯著，突變型葉片表皮有類似瘤狀突起，處于蠟質(zhì)發(fā)育的初始階段，未形成獨(dú)立的蠟質(zhì)顆粒；而野生型葉片表皮蠟質(zhì)數(shù)量明顯多于突變型，蠟質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)為片狀或聚集成團(tuán)。兩者的第1片真葉表皮蠟質(zhì)差異顯著，突變型葉片表皮還未見蠟質(zhì)發(fā)育；而野生型已有逐漸發(fā)育完全的蠟質(zhì)晶體，發(fā)育進(jìn)程由顆粒狀到片狀再到不規(guī)則三維結(jié)構(gòu)。

2.2 三葉苗期甘藍(lán)葉表皮蠟質(zhì)超微結(jié)構(gòu)

三葉苗期的甘藍(lán)葉片已經(jīng)完全暴露到外界環(huán)境中，表觀上突變型與野生型甘藍(lán)幼苗葉片綠色度和光滑度已有差異，突變型葉片光滑且亮綠；野生型葉片覆有蠟粉霜。

電鏡觀察結(jié)果表明（圖2），突變型葉片表皮的背腹面都發(fā)現(xiàn)有蠟質(zhì)晶體存在，但是發(fā)育不健全，以顆粒狀為主，即使片狀也比野生型的蠟質(zhì)晶體?。灰吧拖炠|(zhì)晶體發(fā)育成熟，以片狀、針狀為主。

2.3 結(jié)球前期甘藍(lán)葉表皮蠟質(zhì)超微結(jié)構(gòu)

結(jié)球前期的甘藍(lán)根、莖、葉都處于快速生長時(shí)期。表觀上突變型與野生型葉片綠色度和光滑度差異極為顯著，突變體葉片光滑，顏色亮綠；野生型葉片粉藍(lán)色，覆有蠟粉霜。

電鏡觀察結(jié)果（圖3），突變型與野生型葉片背腹面蠟質(zhì)晶體積累都進(jìn)一步增加。突變型的蠟質(zhì)晶體仍然是顆粒狀，且其數(shù)量腹面比背面多；野生型的蠟質(zhì)晶體排列更加密集，腹背面出現(xiàn)不同的晶體結(jié)構(gòu)，腹面主要是圓柱狀，背面主要是片狀。

圖1 一葉苗期甘藍(lán)葉表皮蠟質(zhì)晶體掃描電鏡觀察結(jié)果（×3000，×2000）

圖2 三葉苗期甘藍(lán)葉表皮蠟質(zhì)晶體掃描電鏡觀察結(jié)果（×3000）

2.4 結(jié)球后期甘藍(lán)葉表皮蠟質(zhì)超微結(jié)構(gòu)

結(jié)球后期的甘藍(lán)根、莖、葉處于生長旺盛時(shí)期，各器官已經(jīng)趨于成熟。表觀上突變型甘藍(lán)的外葉和球葉呈現(xiàn)亮綠色；而野生型甘藍(lán)的外葉呈粉藍(lán)色，球葉呈粉綠色，都覆有蠟粉霜。電鏡觀察此期突變型葉片腹面蠟質(zhì)晶體為顆粒狀，背面蠟質(zhì)晶體不明顯；野生型葉片背腹面蠟質(zhì)晶體密集，以片狀為主（圖4）。

圖3 結(jié)球前期甘藍(lán)葉表皮蠟質(zhì)晶體掃描電鏡觀察結(jié)果（×3000）

圖4 結(jié)球后期甘藍(lán)葉表皮蠟質(zhì)晶體掃描電鏡觀察結(jié)果（×3000）

2.5 成熟期甘藍(lán)葉表皮蠟質(zhì)超微結(jié)構(gòu)

甘藍(lán)成熟期，葉球的外葉數(shù)、質(zhì)量、體積和開展度基本上停止變化，外葉的功能進(jìn)一步退化。縱切突變型與野生型甘藍(lán)葉球，由外到內(nèi)顏色均由綠色到黃綠再到淺黃過度，其心葉顏色無明顯區(qū)別。但外葉顏色差別顯著，突變型的外葉顏色亮綠，野生型外葉粉藍(lán)色且覆有蠟粉霜。電鏡觀察突變型葉表蠟質(zhì)晶體仍然是以顆粒狀為主；野生型蠟質(zhì)晶體由棒狀轉(zhuǎn)化成針狀或片狀，片狀晶體的末端分散，有蠟質(zhì)晶體進(jìn)一步崩潰的跡象（圖5）。

圖5 成熟期甘藍(lán)葉表皮蠟質(zhì)晶體掃描電鏡觀察結(jié)果（×3000）

3 結(jié)論與討論

植物葉片表皮最外層蠟質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)一直是研究的熱點(diǎn)，Koch 和Ensikat（2008）認(rèn)為植物葉片表皮蠟質(zhì)晶體為不規(guī)則的三維結(jié)構(gòu)，垂直分布在葉片表面；Barthlott 等（1998）將植物表皮蠟質(zhì)的微觀形態(tài)結(jié)構(gòu)分為柱狀、棒條狀、垂直片狀、線狀、煙囪狀等26 類，其中片狀和管狀是蠟質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)中最主要的類型。本試驗(yàn)中，野生型甘藍(lán)葉片表皮蠟質(zhì)晶體垂直分布在葉片表面，且不同生長時(shí)期表現(xiàn)出不同的蠟質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)，苗期以顆粒狀、片狀和針狀為主，結(jié)球期以圓柱狀和片狀為主，成熟期以片狀和針狀為主，片狀晶體結(jié)構(gòu)是甘藍(lán)整個(gè)生長期的最主要類型。電鏡觀察蠟質(zhì)發(fā)育過程發(fā)現(xiàn)，當(dāng)蠟質(zhì)晶體積累逐漸增多時(shí)，晶體鑲嵌排列更加緊密，電鏡下觀察不易發(fā)現(xiàn)氣孔結(jié)構(gòu)?？梢酝茰y，蠟質(zhì)晶體密布成網(wǎng)覆蓋在葉片表面，作為葉表天然的保護(hù)層，使甘藍(lán)在生長中期和后期有更強(qiáng)的抗逆性。本試驗(yàn)觀察到甘藍(lán)葉表皮腹面蠟質(zhì)數(shù)量要多于背面，這可能與葉片腹—背軸非對(duì)稱發(fā)育有關(guān)，此觀察結(jié)果也與周小云（2006）、曾愛松等（2009）的研究結(jié)果相似。

另外，本試驗(yàn)通過電鏡觀察發(fā)現(xiàn)突變型甘藍(lán)材料蠟質(zhì)缺失極顯著，與李景濤等（2012）的研究結(jié)果一致。但本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)突變型甘藍(lán)苗期子葉和真葉有顆粒狀和發(fā)育不完全的片狀蠟質(zhì)晶體，而且整個(gè)生長期以顆粒狀晶體結(jié)構(gòu)為主?？梢酝茰y，即使表觀無蠟粉的甘藍(lán)突變體實(shí)際上也有蠟質(zhì)晶體發(fā)育萌芽，可能是某種原因阻礙了蠟質(zhì)晶體的進(jìn)一步發(fā)育，究其是阻斷了蠟質(zhì)合成途徑還是阻礙了蠟質(zhì)運(yùn)輸途徑，或是其他原因，還需要進(jìn)一步探索。

關(guān)于甘藍(lán)葉片表皮蠟質(zhì)突變體已多有報(bào)道，但研究還不夠深入。今后，如果能從分子水平去研究突變基因的功能，成功克隆一些相關(guān)基因，再通過基因工程手段改良角質(zhì)層性狀，從而提高甘藍(lán)的抗旱及抗病能力，這在育種上意義會(huì)更大。

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