放療增強(qiáng)對(duì)轉(zhuǎn)染p Ad KDR／CD／TK自殺基因系統(tǒng)的SW480大腸癌細(xì)胞的殺傷作用

劉志毅，金 虎，翟春亮，劉 明

（吉林大學(xué)第四醫(yī)院 普通外科，吉林 長(zhǎng)春 130011）

目前對(duì)大腸癌的治療，除了外科手術(shù)、化療和放療外，生物治療成為研究熱點(diǎn)，其中基因治療研究較多，而自殺基因最為深入。所謂自殺基因就是藥物敏感基因，能夠?qū)o(wú)毒的藥物前體在體內(nèi)轉(zhuǎn)變成有毒的藥物殺死腫瘤細(xì)胞。該療法不但能直接殺傷轉(zhuǎn)基因的腫瘤細(xì)胞，還可利用其獨(dú)特的“旁觀者效應(yīng)”殺傷周?chē)罅课崔D(zhuǎn)基因的瘤細(xì)胞。放射治療是通過(guò)輻射誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞原發(fā)損傷或者細(xì)胞凋亡，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的死亡。在放療過(guò)程中，射線不但殺死腫瘤細(xì)胞，同時(shí)也會(huì)對(duì)周?chē)＝M織造成損害，而且會(huì)隨著劑量的增加而加大。研究表明，放射線可以增加基因的轉(zhuǎn)染率［1，2］，增強(qiáng)基因的穩(wěn)定表達(dá)；而自殺基因可以增加腫瘤的放射敏感性［3］。自殺基因聯(lián)合放療治療腫瘤，目前以單自殺基因研究較多，而對(duì)雙自殺基因的研究剛剛開(kāi)始，還比較少。本實(shí)驗(yàn)用以構(gòu)建的p KDR－CD／TK融合基因，聯(lián)合γ射線，進(jìn)一步探索雙自殺基因與放療對(duì)大腸癌SW480細(xì)胞的殺傷協(xié)同作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

重組腺病毒（recombinant adenovirus with KDR promoder，p Ad Easy－KDR－CD p Ad Easy－KDR－TK p Ad Easy－KDR－CDgly TK）由吉林大學(xué)普通外科實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建。DMEM、RPMI 1640、MTT、小牛血清（Gibco公司）；轉(zhuǎn)染試劑PolyFect（Qiagen公司）；GCV （Roche Pharma 公司），5－FC（Sigma公司）。

1.2 SW480細(xì)胞的培養(yǎng)

①于15 ml錐形試管內(nèi)加入10 ml PRMI1640細(xì)胞生長(zhǎng)液。②37℃水浴處理冰凍SW480細(xì)胞小瓶40－60 s，并輕輕搖動(dòng)之，室溫下，體積分?jǐn)?shù)70%乙醇浸泡去除污染。③將細(xì)胞懸液加入含10 ml PRMI 1640細(xì)胞生長(zhǎng)液的15 ml錐形試管內(nèi)，（200×g）離心，5 min，吸除細(xì)胞生長(zhǎng)液，加入5 ml新鮮細(xì)胞生長(zhǎng)液。④組織培養(yǎng)瓶，內(nèi)含新鮮PRMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)液10 ml，將細(xì)胞懸液5 ml加入其中，體積分?jǐn)?shù)5%CO2，37℃孵育；當(dāng)細(xì)胞達(dá)到70%匯合時(shí)行1∶3傳代。⑤吸除PRMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)液，用磷酸鹽緩沖溶液（PBS）10 ml清洗細(xì)胞，用Tyrosine－EDTA 1 ml消化3 min。⑥用新鮮PRMI 1640細(xì)胞生長(zhǎng)液8.5 ml滅活Tyrosine，將細(xì)胞懸液1 ml加入培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，在加入新鮮PRMI 1640細(xì)胞液9 ml，在體積分?jǐn)?shù)5%CO2，37℃下孵育。⑦細(xì)胞70%匯合時(shí)傳代。

1.3 p Ad Easy－CDglyTK，p Ad Easy－KDR－CDglyTK重組腺病毒的轉(zhuǎn)染

先將2份3×105LOVO細(xì)胞分別接種于2個(gè)10 ml培養(yǎng)皿中，體積分?jǐn)?shù)5%CO2，37℃培養(yǎng)過(guò)夜，再分別加入10μl重組腺病毒p Ad Easy－CDgly TK p Ad Easy－KDR－CDgly TK 終 質(zhì) 量 濃 度 為 mg／L，37℃，體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)6 h。之后更換新鮮PRMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)液，體積分?jǐn)?shù)5%CO2，37℃培養(yǎng)24 h。熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效果。

1.4 γ射線對(duì)重組腺病毒的SW480細(xì)胞感染率的影響

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SW480細(xì)胞，以1×104／孔的濃度接種于96孔培養(yǎng)板，體積分?jǐn)?shù)5%CO2，37℃培養(yǎng)過(guò)夜，待細(xì)胞豐度達(dá)約90%，加入不同感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection，MOI）的目的腺病毒（分別加入10、20、50、100、200、300MOI），加少許培養(yǎng)基振蕩2－3 h后，補(bǔ)足培養(yǎng)基繼續(xù)在37℃、5%CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)，分別用γ射線照射，劑量為1.0Gy，每日照射1 h，分為照射組與對(duì)照組，3 d后在熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)GFP陽(yáng)性細(xì)胞百分比。

1.5 60 Coγ射線對(duì)轉(zhuǎn)染重組腺病毒的SW480細(xì)胞的殺傷增敏作用

1.5.1 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的轉(zhuǎn)染 p Ad KDR／CD／TK SW480細(xì)胞，及對(duì)照組SW480細(xì)胞（未做任何處置），以2×105／L，接種于96孔板上，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。共分4組：

γ射線的照射的劑量分別為0、0.2、0.5、0.8、1.0、1.5Gy，GCV濃度為10 mg／l，5－FC濃度為100 mg／l，GCV＋5－FC濃度為10 mg／l＋100 mg／l。然后于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)靜止培養(yǎng)，4 d后MTT法計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率。

1.5.2 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的轉(zhuǎn)染p Ad KDR／CD／TK，p Ad KDR／CD，p Ad KDR／TK 的SW480細(xì)胞，及對(duì)照組SW480細(xì)胞（未做任何處置），以2×105／L，接種于96孔板上，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。共分8組：γ射線的照射的劑量分別為1.0，GCV濃度為10、20、40、60、和100 mg／l；5－FC濃度為：100、200、400、600和1 000 mg／l；GCV＋5－FC濃度為：10＋100、20＋200、40＋400、60＋600和100＋1 000 mg／l。，然后于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)靜止培養(yǎng)，4 d后 MTT法計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率。

1.6 細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)γ射線增敏作用

將轉(zhuǎn)染p Ad KDR／CD／TK的SW480細(xì)胞用胰酶消化，使細(xì)胞呈單個(gè)懸浮于培養(yǎng)液中。單個(gè)細(xì)胞百分率在95%以上，將1×105的細(xì)胞接種于6孔板中 ，實(shí)驗(yàn)分為4組：① 對(duì)照組；② 單純用藥組（GCV濃度1μg／ml＋5－FC10 g／ml）；③ 單純照射組，給予Coγ射線照射，吸收劑量為400cGy；④ 聯(lián)合治療組：先加入1μg／mlGCV＋5－FC10 g／mlG處理，后進(jìn)行照射，吸收劑量為400cGy，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)14 d，用PBS小心清洗2遍，空氣干燥，甲醇固定15 min，Giemsa染色15 min，流水緩慢洗去染液，再空氣干燥，顯微鏡下計(jì)數(shù)大于50個(gè)細(xì)胞的克隆。然后按下式計(jì)算克隆形成率：克隆形成率（%）＝（克隆數(shù)／接種細(xì)胞數(shù)）×100%；相對(duì)克隆形成率（%）＝（照射組克隆形成／對(duì)照克隆形成率）×100%。

1.7 統(tǒng)計(jì)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS11.5軟件處理，采取獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)和單因素方差分析，組間比較用SNK法。

2 結(jié)果

2.1 重組腺病毒的PCR鑒定

重組質(zhì)粒經(jīng)PCR鑒定，均檢測(cè)到目的基因表達(dá)（見(jiàn)圖1）。

2.2 γ射線對(duì)重組腺病毒對(duì)SW480細(xì)胞感染率的影響

分為照射組與對(duì)照組，3 d后在熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)GFP陽(yáng)性細(xì)胞百分比。結(jié)果（圖2）轉(zhuǎn)染雙自殺基因的大腸癌細(xì)胞照射組和對(duì)照組轉(zhuǎn)染率有明顯差異（P＜0.01）。

2.3 前藥對(duì)γ射線對(duì)轉(zhuǎn)染重組腺病毒的SW480細(xì)胞的殺傷協(xié)同作用

2.3.1 轉(zhuǎn)染p Ad KDR／CD／TK SW480細(xì)胞和對(duì)照的SW480細(xì)胞，均給予GCF＋5－FC和γ射線照射，其生長(zhǎng)率如圖3。γ射線0.2Gy時(shí)，生存率分別為（32.2±4.3）%和（86.6±4.6）%；γ射線0.5Gy時(shí)，生存率分別為（11.3±3.1）%和（75.2±4.8）%；γ射線0.8Gy時(shí)，生存率分別為（6.5±1.4）%和（68.8±5.2）%；γ射線1.0Gy時(shí)，生存率分別為（1.6±0.3）%和（47.2±3.7）%；γ射線1.5Gy時(shí)，生存率分別為（0.2±0.06）%和（33.9±2.4%）；提示轉(zhuǎn)染p Ad KDR／CD／TK SW480細(xì)胞比對(duì)照組對(duì)前藥＋γ射線更為敏感（各組P＜0.001）。

2.3.2 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的轉(zhuǎn)染p Ad KDR／CD／TK，p Ad KDR／CD，p Ad KDR／TK的SW480細(xì)胞，及對(duì)照組SW480細(xì)胞（未做任何處置），分別給予不同濃度GCV、5－FC及 GCV＋5－FC。MTT法計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率。結(jié)果（圖4）：TK＋CD／G＋F組和TK＋CD／G＋F＋γ組比較，前藥為10／100時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)率分別為（87.4±5.2）%和（31.2±3.8）%；20／200時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)率分別為（64.9±5.6）%和（23.5±4.1）%；40／400時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)率為（56.2±4.8）%和（19.7±3.2）%；60／600時(shí)分別為（33.1±2.6）%和（2.1±0.2）%；100／1000時(shí)分別為（20.9±2.3）%和（1.3±0.3）%。兩組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

2.4 細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)γ射線增敏作用

見(jiàn)表1。單純用藥組和對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。聯(lián)合治療組和單純用藥組比有顯著差異（P＜0.0005）。而聯(lián)合治療組（G＋F）與單純放射組比相對(duì)克隆率分別為16.8%和59.6%，聯(lián)合用藥（G＋F）與單藥（G）、（F）的相對(duì)克隆形成率分別為16.8%和43.8%、46.0%。提示γ射線對(duì)聯(lián)合應(yīng)用GCV＋5－FC比單獨(dú)應(yīng)用GCV或5－FC具有明顯的曾敏作用；TK／CD雙自殺基因的曾敏作用明顯高于單自殺基因TK或CD（P＜0.001）。

3 討論

研究表明，自殺基因?qū)Υ竽c癌細(xì)胞具有殺傷作用［4－8］，Takeharu kanazawa等［9］報(bào)道 γ射線照射能夠增強(qiáng)TK／GCV在癌細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染率和表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)利用已構(gòu)建的Adp KDR－TK／CD腺病毒載體，轉(zhuǎn)染大腸癌SW480細(xì)胞，給予前藥聯(lián)合γ射線照射，觀察雙自殺基因和γ射線照射的協(xié)同增效作用。①轉(zhuǎn)染率：用不同的MOI轉(zhuǎn)染SW480細(xì)胞，并用γ射線1Gy照射，當(dāng)MOI值為10、20、50時(shí)對(duì)照組分別是對(duì)照組的10.2倍、5.5倍、2.1倍，說(shuō)明γ射線照射能明顯提高雙自殺基因的轉(zhuǎn)染效率，并且MOI值較低時(shí)作用明顯。其原理可能是因?yàn)檩椛涫故苷占?xì)胞表面受損及穿孔，引起細(xì)胞膜通透性和跨膜電位的改變，便于帶負(fù)電荷的外源基因主動(dòng)進(jìn)人細(xì)胞，隨著輻射劑量的增加細(xì)胞內(nèi)基因產(chǎn)物的量也相應(yīng)增加。再有輻射導(dǎo)致受體細(xì)胞DNA損傷，從而激活細(xì)胞的修復(fù)機(jī)制，在修復(fù)過(guò)程中由于剪切和重組的發(fā)生，很容易使外源DNA和受體DNA發(fā)生重組整合。Stevens等［10］發(fā)現(xiàn)用9Gy的γ射線照射可以將質(zhì)粒載體介導(dǎo)的DNA的初始轉(zhuǎn)染效率提高1400倍。雖然本實(shí)驗(yàn)γ射線量較小，但轉(zhuǎn)染率提高也很明顯。②自殺基因＋前藥對(duì)γ射線的增敏作用：轉(zhuǎn)染 p Ad KDR／CD／TK SW480 細(xì) 胞／γ 組 和 轉(zhuǎn) 染p Ad KDR／CD／TK SW480細(xì)胞／GCV＋5－FC＋γ組相比，分別給予 GCV／5－FC100μg／ml＋1 000μg／ml，當(dāng)γ射線0.2Gy、0.5Gy、0.8Gy、1.0Gy、1.5Gy其細(xì)胞生存率前者分別是后者的2.6倍、5.6倍、7.6倍、20.3倍和141.5倍。其可能的機(jī)制是輻射使受照細(xì)胞基因轉(zhuǎn)染率升高，DNA受損、斷裂，并且射線對(duì)處于G1期細(xì)胞殺傷作用強(qiáng)，而5－FU對(duì)于處于S期的細(xì)胞殺傷作用明顯；放療可使藥物從受到損傷的細(xì)胞中釋放出來(lái)，因而強(qiáng)化了基因治療的“旁觀者效應(yīng)”。③γ射線對(duì)自殺基因的增敏作用：TK＋CD／G＋F組和TK＋CD／G＋F＋γ組比較，給予γ射線1.0Gy照射，并給予前藥GCV＋5－FC分別為10μg／ml＋100μg／ml、20μg／ml＋200μg／ml、40μg／ml＋400μg／ml、60μg／ml＋600μg／ml、100 μg／ml＋1 000μg／ml。兩組比較前者的細(xì)胞生存率是后者的2.8倍、2.8倍、2.8倍、16倍、16倍。提示自殺基因?qū)Ζ蒙渚€的增敏作用，其機(jī)制可能是：前藥改變腫瘤細(xì)胞敏感性，主要是通過(guò)促進(jìn)促凋亡基因bax的轉(zhuǎn)錄、抑制凋亡基因bcl－2的轉(zhuǎn)錄，以增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)放療的敏感性；或者使腫瘤細(xì)胞阻滯于G1期，而G1后期對(duì)放療敏感，從而提高腫瘤細(xì)胞對(duì)輻射的敏感性，磷酸化的前體藥物攙入DNA中可干擾放射損傷的修復(fù)，還可對(duì)抗放療后腫瘤細(xì)胞的再增殖。

表1 SW480細(xì)胞克隆形成率與相對(duì)克隆形成率

綜上所述，通過(guò)本實(shí)驗(yàn)提示我們，自殺基因聯(lián)合放療：① 放射線可提高基因轉(zhuǎn)移的效率［11］，因而提高了基因治療的效果。② 磷酸化的前體藥物攙入DNA中可干擾放射損傷的修復(fù)。③ 放療可使藥物從受到損傷的細(xì)胞中釋放出來(lái)，因而強(qiáng)化了基因治療的“旁觀者效應(yīng)”。④ 基因治療可增強(qiáng)放療的療效 ，例如直接殺傷或抑制，腫瘤細(xì)胞的基因治療聯(lián)合放療不但能提高腫瘤細(xì)胞的殺傷能力，還可對(duì)抗放療后腫瘤細(xì)胞的再增殖，從而提高療效。⑤ 基因治療可增強(qiáng)放療的療效，提高其放射敏感性，減少前藥的用量，降低射線照射的劑量，可減輕前藥的副作用和正常組織的放射性損傷，為提高放療療效提供了可能性。

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