格爾德霉素對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞MT1－MMP及u－PA基因表達(dá)的影響

王春輝，李蘊(yùn)潛，韓雪梅

（1.吉林省人民醫(yī)院 神經(jīng)外科，吉林 長(zhǎng)春 130021；2.吉林大學(xué)第一醫(yī)院 神經(jīng)外科；3.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科）

膠質(zhì)瘤侵襲性生長(zhǎng)的發(fā)生機(jī)制一直是研究的熱點(diǎn)，然而，迄今尚未取得突破性進(jìn)展。肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（hepatocyte growth factor，HGF）是一種多功能的細(xì)胞因子，主要通過(guò) HGF／c－Met通路促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡和侵襲［1，2］。格爾德霉素（geldanamycin，GDM）對(duì)HGF具有明顯的抑制作用，能夠阻斷HGF／c－Met通路。本研究擬探討GDM作用下，HGF／c－Met通路下游基因膠質(zhì)瘤細(xì)胞膜型基質(zhì)金屬蛋白酶－1（Membrane type 1 matrix metalloproteinase，MT1－MMP）和尿激酶型纖溶酶原激活物（Urokinase－type plasminogen activator，u－PA）表達(dá)情況，旨在為深入認(rèn)識(shí)其侵襲性生長(zhǎng)的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

異硫氰酸胍（Trizol）購(gòu)自上海生工工程公司，HGF購(gòu)自美國(guó)Calbiochem公司，GDM購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，美國(guó)PE公司PCR擴(kuò)增儀。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)分組

37℃，5%CO2條件下，用含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)U87和U251細(xì)胞（吉林省腫瘤研究所提供）。用終濃度為30μg／L的HGF作用24 h后，加入濃度為1 000 nmol／L的GDM處理48 h，收集細(xì)胞，Trizol法提取總RNA。實(shí)驗(yàn)分為正常對(duì)照組、HGF組、GDM組和 HGF＋GDM組。

1.3 總RNA提取

將收集的細(xì)胞轉(zhuǎn)至1.5 ml EP管中，加入800 μl Trizol，混勻，室溫放置5 min；加入200μl氯仿劇烈振蕩30 s，室溫3 min；12 000 r／min，離心5 min；吸上清至另一1.5 ml EP管中，加入等體積異丙醇混勻室溫放置30 min；12 000 r／min，離心10 min；移去上清，加1 ml 75%冷乙醇（4℃）洗1～2次，4℃，8 000 r／min，離心5 min，棄上清，適中干燥，50 μl DEPC水重懸，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA質(zhì)量。

1.4 反轉(zhuǎn)錄為cDNA

20μl反應(yīng)體系（冰上操作），包含RNA 2.0μg，Oligo（d T）（25 pmol／L）3.0μl，Mg2＋（25 mmol／L）4μl，d NTP（10 mmol／L）2.0μl，AMV （10 U／μl）1.0μl，RNase inhibitor（40 U／μl）1.0μl，RNase Free H2O補(bǔ)足至總體積為20μl。設(shè)置反應(yīng)條件：42℃60 min，95℃5 min，冰浴5 min。

1.5 MT1－MMP及u－PA mRNA相對(duì)含量檢測(cè)

運(yùn)用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)引物：MT1－MMP引物：上游：5′－GCC CTA TGC CTA CAT CCG －3′；下游：5′－TGT CAA AGT TCC CGT CAC AG－3′，擴(kuò)增片段488 bp。u－PA 引物：上游：5′－TAA CTC CAA CAC GCA AGG－3′；下游：5′－CAG CAA GGC AAT GTC GTT－3′，擴(kuò)增片段106 bp。β－actin引物：上游：5′－AGC GAG CAT CCC CCA AAG TT－3′；下游：5′－GGG CAC GAA GGC TCA TCA TT－3′，擴(kuò)增片段285 bp。引物由大連寶生物公司合成。按照如下反應(yīng)條件擴(kuò)增目的基因：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性45 s，56℃退火45 s，72℃延伸1 min，共40個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，圖象分析儀分析目的條帶和內(nèi)參照βactin的灰度，并計(jì)算兩者比值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，SPSS 12.0軟件處理數(shù)據(jù)，組間比較采用方差分析及兩兩比較的q檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

U87細(xì)胞結(jié)果見(jiàn)表1，圖1。與正常對(duì)照組（NC）相比，HGF組u－PA mRNA 表達(dá)顯著增加（P＜0.05）；GDM 組 MT1－MMP和u－PA m RNA表達(dá)水平較對(duì)照組和 HGF組均顯著降低（P＜0.05）；HGF＋GDM組u－PA mRNA表達(dá)水平較對(duì)照組和HGF組顯著降低（P＜0.05）。

U251細(xì)胞結(jié)果見(jiàn)表1，圖2。與正常對(duì)照組（NC）相比，HGF組 MT1－MMP及u－PA mRNA表達(dá)均顯著增加（P＜0.05）；GDM 組 MT1－MMP和u－PA mRNA表達(dá)水平較對(duì)照組均顯著降低（P＜0.05）；HGF＋GDM 組 MT1－MMP和u－PA m RNA表達(dá)水平較HGF組均顯著降低（P＜0.05）；與單純GDM組相比，HGF＋GDM 組 MT1－MMP m RNA水平顯著增高（P＜0.05）。

表1 Expression of MT1－MMP and u－PA mRNA in U87 and U251 glioma cells（±s，n＝3）

表1 Expression of MT1－MMP and u－PA mRNA in U87 and U251 glioma cells（±s，n＝3）

＊P＜0.05 vs NC，＃P＜0.05 vs HGF，＆P＜0.05 vs GDM

Group The rate of gray scale MT1－MMP u－PA U87 NC 1.174±0.081 1.009±0.013 HGF 1.198±0.028 1.171±0.028＊GDM 1.123±0.019＊＃ 0.863±0.016＊＃HGF＋GDM 1.126±0.056 0.892±0.026＊＃U251 NC 1.411±0.011 1.354±0.042 HGF 1.486±0.075＊ 1.407±0.035＊GDM 1.288±0.018＊＃ 1.221±0.017＊＃HGF＋GDM 1.349±0.036＃＆ 1.231±0.073＃

圖1 Electrophoresis pictures of the effect of GDM on MT1－MMP and u－PA m RNA expression in U87 glioma cell

圖2 Electrophoresis pictures of the effect of GDM on MT1－MMP and u－PA mRNA expression in U251 glioma cell

3 討論

膜型基質(zhì)金屬蛋白酶－1（MT1－MMP）是位于細(xì)胞膜上的基質(zhì)金屬蛋白酶，其不僅可以直接降解細(xì)胞外基質(zhì)，而且能通過(guò)促進(jìn) MMP－前體 （pro－MMP－2）的活化，間接的降解細(xì)胞外基質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn)，在胃癌、肺癌、甲狀腺癌和膠質(zhì)瘤等腫瘤組織中，MT1－MMP的表達(dá)與腫瘤惡性程度和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［3］。上調(diào) MT1－MMP能夠促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移［4］，下調(diào)MT1－MMP能夠抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移［5］。

尿激酶型纖溶酶原激活物（u－PA）是由腫瘤細(xì)胞或組織細(xì)胞分泌的絲氨酸蛋白酶，既可以酶原形式，也可以活性酶形式結(jié)合到特定的細(xì)胞表面受體，激活成雙鏈活性形式，活性u(píng)－PA可使纖溶酶原激活，除了可催化纖維蛋白、纖維粘連蛋白、層粘連蛋白等的降解，還可活化基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）1、3、9、12，從而進(jìn)一步破壞細(xì)胞外基質(zhì)，促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。高建洲等［6］報(bào)道，膠質(zhì)瘤u－PA的陽(yáng)性表達(dá)可能與其發(fā)生和惡性程度有關(guān)。膠質(zhì)瘤細(xì)胞分泌的u－PA提供了啟動(dòng)腫瘤侵襲過(guò)程的關(guān)鍵性細(xì)胞機(jī)制，是造成腦膠質(zhì)瘤治療失敗的主要因素。Schuler等［7］報(bào)道u－PA在膠質(zhì)母瘤C6中顯著高表達(dá)，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示，u－PA僅存在于浸潤(rùn)區(qū)和血管基底層，并呈持續(xù)高表達(dá)。關(guān)于HGF與u－PA的關(guān)系，研究顯示，HGF與受體c－Met作用后可使u－PA及其受體表達(dá)上調(diào)，HGF可通過(guò)誘導(dǎo)u－PA的表達(dá)來(lái)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲能力，這一過(guò)程可被一些植物提取物，例如異硫氰酸芐酯阻斷［8］。

在研究運(yùn)用反轉(zhuǎn)錄PCR對(duì) MT1－MMP及u－PA m RNA進(jìn)行半定量分析，結(jié)果顯示：HGF能顯著促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中 MT1－MMP及u－PA mRNA表達(dá)，而格爾德霉素顯著抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞中MT1－MMP和u－PA表達(dá)，且明顯逆轉(zhuǎn) HGF對(duì) MT1－MMP及u－PA基因的表達(dá)增加趨勢(shì)。由此推測(cè)，格爾德霉素可能通過(guò)抑制HGF－Met通路，降低該通路下游基因MT1－MMP及u－PA的表達(dá)，進(jìn)而降低MMP－2、MMP－9活性，抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲能力。

［1］王春輝，李蘊(yùn)潛，羅毅男，等.格爾德霉素對(duì)肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子引起的人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖與凋亡變化的影響 ［J］.中國(guó)老年學(xué)雜志，2008，28（3）：278.

［2］王春輝，李蘊(yùn)潛，羅毅男，等.格爾德霉素對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖及相關(guān)基因表達(dá)的影響 ［J］.吉林大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2008，34（2）：199.

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［5］Yongjun Y，Shuyun H，Lei C，et al.Atorvastatin suppresses glioma invasion and migration by reducing microglial MT1－MMP expression［J］.J Neuroimmunol，2013，260（1－2）：1.

［6］高建洲，孔 昕，柳紅艷，等.MMP－9和uPA在腦膠質(zhì)瘤中的陽(yáng)性表達(dá)及意義 ［J］.山東醫(yī)藥，2013，53（5）：62.

［7］Schuler PJ，Bendszus M，Kuehnel S，et al.Urokinase plasminogen activator，uPAR，MMP－2，and MMP－9 in the C6－glioblastoma rat model［J］.In Vivo，2012，26（4）：571.

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