超高壓技術(shù)對草莓汁果膠甲酯酶鈍化作用的研究

張波波，王 丹，馬 越，張 超，趙曉燕，霍乃蕊，*

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，山西晉中030801；2.北京市農(nóng)林科學(xué)院蔬菜研究中心、果蔬農(nóng)產(chǎn)品保鮮與加工北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、農(nóng)業(yè)部華北地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、農(nóng)業(yè)部都市農(nóng)業(yè)（北方）重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100097）

草莓果實(shí)多汁，甜酸可口，含有豐富Ca、P、K等元素，并且還富含多種有益生物活性物質(zhì)[1]。但是草莓易腐爛及易形成機(jī)械損傷，不耐運(yùn)輸及貯藏，對其進(jìn)行深加工，如加工草莓汁等不僅可以充分有效利用草莓，而且可以進(jìn)一步提高其附加值[2]。殺菌滅酶過程是制作草莓汁必須經(jīng)歷的步驟，熱處理可以有效殺滅草莓汁中微生物及鈍化內(nèi)源酶[3]，然而傳統(tǒng)熱殺菌會造香氣損失或產(chǎn)生異味，甚至破壞草莓中維生素C及其他生物活性物質(zhì)。超高壓技術(shù)是非熱殺菌的新技術(shù)，其利用100～1000MPa高壓作用影響細(xì)胞的形態(tài)，改變維持物質(zhì)分子立體結(jié)構(gòu)的氫鍵、離子鍵等一些非共價鍵[4]，達(dá)到殺菌滅酶目的，已被證明可以較大程度地維持原始產(chǎn)品性質(zhì)[5-6]。

草莓中含有多種內(nèi)源酶，這些內(nèi)源酶的存在影響草莓及其制品的風(fēng)味、顏色及穩(wěn)定性等品質(zhì)[3，7]。其中草莓中的果膠甲酯酶與果實(shí)軟化有很大關(guān)系，其與果膠半乳糖醛酸殘基C6處羧基發(fā)生作用，導(dǎo)致果膠去甲酯化，催化果膠生成果膠酸及甲醇[8]，影響果汁渾濁穩(wěn)定性，因此鈍化果膠甲酯酶對保持草莓汁貯藏期間粘度、質(zhì)構(gòu)等品質(zhì)有深遠(yuǎn)意義。由于超高壓技術(shù)的非熱殺菌性質(zhì)使超高壓可以盡量保持草莓制品原始性質(zhì)，并且起到殺菌滅酶作用，因此是草莓汁加工的一種潛在的有效方法。劉野等[9]研究認(rèn)為，隨處理壓力升高，超高壓技術(shù)對PME酶鈍化效果越好，Lacroix等[10]研究表明經(jīng)50℃預(yù)熱10m in，在pH 3.75～4.0時，橘子汁PME酶對超高壓處理非常敏感。Nguyen[11]研究認(rèn)為從草莓汁中提取的PME酶經(jīng)超高壓處理，隨處理壓力升高，酶活被鈍化程度加深。目前對于不同壓力、不同時間、不同溫度、不同處理次數(shù)超高壓處理對調(diào)配草莓飲料體系中的PME酶鈍化效果的系統(tǒng)研究較少。由于PME酶活性與超高壓處理壓力、時間、溫度及體系pH等都有很大關(guān)系，本研究系統(tǒng)考察不同超高壓處理對pH 3.95的調(diào)配草莓汁飲料體系中PME酶的鈍化效果，旨在為調(diào)配草莓汁產(chǎn)品的生產(chǎn)提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

草莓 品種為豐香，購買于農(nóng)貿(mào)市場；果膠裂解酶（10000PECTU/m L） 諾維信（中國）生物技術(shù)有限公司；抗壞血酸 天津市弘喜泰化工貿(mào)易有限公司；胭脂紅 上海染料研究所有限公司；CMC 新樂市潤灃化工商貿(mào)有限公司；EDTA 汕頭市龍湖區(qū)萬吉工業(yè)區(qū)海河路中段；山梨酸鈉 南通奧凱生物技術(shù)開發(fā)有限公司；黃原膠 山東阜豐發(fā)酵有限公司；檸檬酸（≥99.5%） 北京化工廠；果膠 美國Sigma公司。

FPG7100型超高壓實(shí)驗(yàn)處理裝置 英國STANSTED公司；FT74X-40-44-A型超高溫瞬時滅菌儀 英國Arm field公司；NS1oo1L2K型高壓均質(zhì)機(jī) 意大利GEA Niro Soavi公司；T65D型高速剪切機(jī) 德國IKA公司；TZ3230電位自動滴定儀 德國SCHOOT公司；打漿機(jī)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 草莓汁的制備 新鮮草莓-80℃凍藏→去萼→蒸餾水清洗→4℃解凍12h→打漿→加果膠裂解酶（加酶量0.1%、酶解溫度50℃、酶解時間3h）→滅酶（條件85℃，5min），四層紗布過濾→調(diào)配（后放入4℃冰箱冷藏待超高壓及UHT處理）。

配方：酶解草莓汁20%、抗壞血酸0.05%、胭脂紅0.0025%、CMC 0.1%、EDTA 0.01%、山梨酸鈉0.025%、黃原膠0.05%；將上述溶液使用果葡糖漿將糖度調(diào)節(jié)為7.5°；檸檬酸調(diào)節(jié)pH至3.95。將以上物質(zhì)混勻，緩慢倒入溶液中，攪拌至溶解，若仍有大量不溶物，則高速剪切5m in，待氣泡消去后，進(jìn)行兩次高壓均質(zhì)，第一次30MPa，第二次50MPa，以增加果汁穩(wěn)定性。

以按上述配方調(diào)配后，未進(jìn)行滅菌處理的草莓汁為對照組。

1.2.2 草莓汁的超高壓處理 用聚乙烯塑料袋對草莓汁進(jìn)行真空密封，包裝好后放入超高壓裝置的反應(yīng)釜內(nèi)。在30℃協(xié)同，處理20min時，考察200、400、600MPa對酶的鈍化作用。并分別考察30℃協(xié)同400MPa時，20、40、60m in處理及10、20m in 2次處理對酶鈍化作用；400MPa處理20m in時，30、45、60℃處理對酶的鈍化作用。處理結(jié)束后冷卻至室溫。

1.2.3 草莓汁的UHT處理 調(diào)節(jié)設(shè)備參數(shù)126℃處理15s，冷凝水（75±1）℃，待穩(wěn)定后，將草莓汁倒入UHT物料倉，及時進(jìn)行無菌灌裝并迅速冷卻至室溫。

1.2.4 PME酶活性的測定 參照Kimball等[12]的方法，稍作修改。

1.2.4.1 底物溶液的配制 10g/L的果膠溶液，含有0.1mol/L NaCl（在大燒杯中量取900m L左右蒸餾水，放于50℃磁力攪拌器上進(jìn)行攪拌加熱，緩慢將10g果膠以及5.85g NaCl倒入溫水中，使之充分溶解，待溶液冷卻后定容為1000m L，用一定濃度NaOH溶液將果膠溶液調(diào)節(jié)pH為7.5后放于4℃冰箱貯藏待用）。

1.2.4.2 酶活測定 取40m L的10g/L果膠溶液于（30± 1）℃，恒溫水浴。加入1.6m L（V1）果汁，以0.05mol/L（C）的NaOH調(diào)節(jié)混合液pH7.5，加入0.02m L（V2）0.05mol/L NaOH，開始計時，記錄體系回到pH 7.5的時間（t）。PME活性以（U/m L）計。

1.2.5 貯藏期 處理后草莓汁需要放于10℃冷庫，貯藏30d。檢測貯藏0、30d的酶殘余活性。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析 采用SPSS 17.0進(jìn)行因子方差分析及Ducan’s多重檢驗(yàn)（p＜0.05）。所有處理均重復(fù)三次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同超高壓壓力處理及UHT處理對調(diào)配草莓汁PME酶鈍化作用研究

由不同處理壓力實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析，200MPa及400MPa處理與UHT對PME鈍化效果一樣，考慮到600MPa處理所需成本較大，而前期實(shí)驗(yàn)表明200MPa處理不能有效殺滅草莓汁中微生物。因此選擇400MPa進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)。2.1～2.4均為剛處理后，貯藏0d時的酶活情況；2.5為貯藏30d后酶活情況。

圖1 不同超高壓處理及UHT處理對調(diào)配草莓汁PME酶殘余活性的影響Fig.1 Effectof different pressure（HP）processing and UHT processing on strawberry juice residual PME activity

由圖1可知，以對照組草莓汁PME酶活為100%，四種處理草莓汁PME酶活性與對照組相比都顯著降低（p＜0.05）。UHT處理與200MPa及400MPa處理對PME鈍化程度相當(dāng)，殘余活性分別為79.5%、83.3%及72.1%，顯著高于600MPa處理。

超高壓處理壓力升高至600MPa處理對PME酶鈍化最強(qiáng)，達(dá)到約52.2%，與較低兩個壓力處理相比差異顯著（p＜0.05）。該結(jié)論與李艷霞等[13]結(jié)論相似，其認(rèn)為較低壓力處理荔枝果肉，PME酶蛋白發(fā)生可逆變性，并出現(xiàn)活性上升，較高壓力處理PME酶才開始鈍化。劉野等[9]研究認(rèn)為經(jīng)超高壓處理后，6.69μmol/L PME純酶溶液的活性隨著處理壓強(qiáng)的升高而下降，實(shí)驗(yàn)最高壓力600MPa，60min處理時，PME酶的活性殘存率為25.6%達(dá)到最低水平。另外Hayakawa等[14]認(rèn)為靜態(tài)超高壓鈍化內(nèi)源酶活性原因是由于對較弱疏水鍵的影響使蛋白結(jié)構(gòu)部分解連或分子重排，形成只具有部分活性或無活性中心的結(jié)構(gòu)，對蛋白的解連或重排作用更明顯。因此超高壓處理壓力越高，蛋白活性中心改變更大，更易造成內(nèi)源酶鈍化。

本研究結(jié)果600MPa處理20m in PME殘余活性約52.2%與劉野等研究結(jié)果相比相對較高，其原因可能是與劉野研究的處理體系不同，劉野研究超高壓對純酶溶液的鈍化效果，而本研究對象為調(diào)配草莓汁。另一個可能的原因是本實(shí)驗(yàn)以完成調(diào)配的草莓汁為對照，調(diào)配草莓汁與鮮榨草莓汁相比PME活性僅有23.47%，并且酶處于食品體系中較難鈍化。

2.2 不同超高壓處理時間及UHT處理對調(diào)配草莓汁PME酶鈍化作用研究

圖2 不同超高壓時間處理及UHT處理對調(diào)配草莓汁PME酶殘余活性的影響Fig.2 Effect of different dwell time（HP）processing and UHT processing on strawberry juice residual PME activity

圖2表示，UHT及不同超高壓處理時間與對照組相比都可以鈍化PME活性（p＜0.05）。UHT處理與20min處理對PME鈍化程度相當(dāng)，而延長時間（40～60m in）處理與UHT處理相比對PME鈍化顯著增強(qiáng)（p＜0.05）。

超高壓處理時間由20m in延長到40m in對PME鈍化并無增強(qiáng)，而60min處理與20min處理相比，60min處理對PME鈍化顯著增強(qiáng)（p＜0.05），與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果類似，徐增慧等[8]研究表明400MPa，20m in高靜壓處理與400MPa，30m in處理桃汁PME酶活性基本無差異。隨超高壓保壓時間在較小范圍內(nèi)延長，PME酶活性升高或基本不變。

本研究結(jié)果產(chǎn)生的原因可能是與生物大分子結(jié)合或與膜結(jié)合的酶分子隨著處理時間延長20m in至40min逐漸解離，被釋放于草莓汁體系與游離的被超高壓鈍化的PME酶量剛好達(dá)到動態(tài)平衡；也可能是由于草莓汁經(jīng)調(diào)配后與鮮榨汁相比PME酶活性剩余較少，基數(shù)小不易鈍化；或者是超高壓處理使調(diào)配草莓汁產(chǎn)生PME同工酶[15]，與被超高壓鈍化的酶量達(dá)到平衡，因此該時間段內(nèi)超高壓處理對酶的鈍化效果并沒有因處理時間延長而增強(qiáng)，而60m in處理與20m in處理相比可以使之活性降低（p＜0.05），其原因可能是由于較長時間處理打破了由于超高壓鈍化的酶與新釋放的酶的平衡。

2.3 熱協(xié)同超高壓處理及UHT處理對調(diào)配草莓汁PME酶鈍化作用研究

圖3 不同熱協(xié)同超高壓處理及UHT處理對調(diào)配草莓汁PME酶殘余活性的影響Fig.3 Effectof thermal synergy ultrahigh pressure processing and UHT processing on strawberry juice residual PME activity

通過圖3可知，三種溫度協(xié)同超高壓處理及UHT處理與對照組相比都導(dǎo)致PME顯著鈍化。而隨著協(xié)同溫度上升，PME酶殘余活性基本無變化。該現(xiàn)象的原因可能有兩種：a.由于調(diào)配后草莓汁與鮮榨草莓汁相比PME活性剩余較小，中溫協(xié)同超高壓并不能對PME酶鈍化產(chǎn)生較強(qiáng)影響；b.由于在30℃處理時，PME酶活性已經(jīng)達(dá)到該壓力及保壓時間條件下最小值，PME酶的殘余活性由其他條件（超高壓處理壓力、處理次數(shù)及體系pH）決定。

2.4 不同超高壓處理次數(shù)及UHT處理對新鮮調(diào)配草莓汁PME酶殘余活性的影響

從圖4可知，超高壓壓力400MPa，協(xié)同溫度30℃，20m in處理1次、10m in處理2次、40m in處理1次及20m in處理2次對PME酶鈍化作用并沒有區(qū)別，其原因可能與2.2及2.3所述原因相似。劉建華[16]認(rèn)為增加超高壓處理次數(shù)會增加內(nèi)源酶的解離程度，并且第一次處理解離程度最大，然而由于該實(shí)驗(yàn)對照組酶活性僅占鮮榨草莓汁PME酶活性的23.47%，導(dǎo)致增加超高壓處理次數(shù)只能引起很少的甚至不能使草莓汁破碎細(xì)胞附著的PME酶釋放。

2.5 貯藏后調(diào)配草莓汁PME酶殘余活性的變化

由圖1～圖4可知，貯藏30d后，發(fā)現(xiàn)UHT處理及不同超高壓處理PME酶活分別與各自0d貯藏相比并無顯著差異。然而UHT處理貯藏30d樣品與60℃協(xié)同400MPa超高壓處理20m in貯藏30d樣品相比PME活性較高（p＜0.05），說明雖然60℃協(xié)同超高壓處理與UHT相比在剛處理后不能有效鈍化PME，但可以有效鈍化貯藏期PME活性。

圖4 不同超高壓處理次數(shù)及UHT處理對調(diào)配草莓汁PME酶殘余活性的影響Fig.4 Different ultrahigh pressure batch number and UHT processing on strawberry juice residual PME activity

3 結(jié)論

3.1 UHT處理及不同超高壓處理與對照組相比都可顯著鈍化草莓汁PME活性。

3.2 600MPa（30℃，20min）處理，40～60min（30℃，400MPa）處理，60℃協(xié)同（20m in，400MPa）超高壓處理及增加超高壓處理次數(shù)與UHT處理相比對PME的鈍化顯著增強(qiáng)。

3.3 超高壓處理壓力升高至600MPa與較低壓力400MPa相比能有效鈍化PME活性；超高壓處理時間延長至60m in與處理20m in相比可有效鈍化PME活性；30～60℃協(xié)同超高壓處理PME鈍化程度無顯著區(qū)別；處理時間一定，增加超高壓處理次數(shù)不能有效鈍化PME活性?？芍?，增大處理壓力及延長處理時間對調(diào)配草莓汁PME鈍化有深遠(yuǎn)意義。

[1]張立云，曹霞敏，李靜，等.超高壓對草莓漿殺菌效果及微生物菌落形態(tài)的影響[J].食品工業(yè)科技，2009，30（11）：109-112.

[2]潘見，曾慶梅，謝慧明，等.草莓汁的超高壓殺菌研究[J].食品科學(xué)，2004，25（1）：31-34.

[3]許文文，曹霞敏，廖小軍.熱燙方式對草莓內(nèi)源酶與主要品質(zhì)影響的研究[J].中國食物與營養(yǎng)，2011，17（8）：25-32.

[4]郭曉暉，方國姍，李富華，等.超高壓處理對草莓果漿品質(zhì)的影響[J].食品科學(xué)，2012，33（21）：121-126.

[5]宋丹丹，馬永昆，蔣家奎，等.超高壓處理對大蒜風(fēng)味的影響[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2008，34（5）：87-91.

[6]劉野，趙曉燕，胡小松，等.超高壓對鮮榨西瓜汁殺菌效果和風(fēng)味的影響[J].農(nóng)業(yè)工程學(xué)報，2011，27（7）：370-376.

[7]曹霞敏，許文文，廖小軍，等.高靜壓工藝中單元操作對草莓汁飲料中抗氧化物質(zhì)含量與抗氧化活性影響[J].中國食物與營養(yǎng)，2011，17（10）：30-35.

[8]徐增慧，郭宏，賈建會，等.高靜壓對桃汁殺菌、鈍化酶活性的效果[J].食品科學(xué)，2011，32（21）：102-106.

[9]劉野，張超，趙曉燕，等.高壓二氧化碳和超高壓對多酚氧化酶和果膠甲酯酶結(jié)構(gòu)的影響[J].食品科學(xué)，2011，32（11）：83-87.

[10]Lacroix N，F(xiàn)liss I，Makhlouf J，et al.Inactivation of pectin methylesterase and stabilizationof opalescence in orange juice by dynamic high pressure[J].Food Research International，2005（38）：569-576.

[11]Nguyen B L，Loey A M V，F(xiàn)achin D，et al.Strawberry Pectin Methylesterase（PME）：Purification，Characterization，Thermal and High-Pressure Inactivation[J].Biotechnol Prog，2002（18）：1447-1450.

[12]Kimball D A.Citrus processing quality control and technology[M].New York：Van Nostrand Reinhold，1991：473.

[13]李艷霞，張水華，劉仲明，等.超高壓加工對荔枝果肉中兩種品質(zhì)酶的影響[J].食品工業(yè)科技，2005（11）：44-47.

[14]Isao H，Linko Y Y，Linko P.Mechanism of high pressure denaturation of proteins[J].Food Science and Technology，1996（29）：756-762.

[15]王章存，徐賢.超高壓處理對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及功能性質(zhì)影響[J].糧食與油脂，2007（11）：10-12.

[16]劉建華.瞬時高壓作用對多酚氧化酶活性與構(gòu)象影響的研究[D].南昌：南昌大學(xué)，2007.