重組β-葡萄糖苷酶基因和內(nèi)切葡聚糖苷酶基因在大腸桿菌中的共表達(dá)

唐自鐘，劉 姍，2，韓學(xué)易，陳 惠，*，孫 蓉，單 志，茍 琳，吳 琦

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與理學(xué)院，四川雅安625014；2.攀枝花學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院，四川攀枝花617000）

當(dāng)代社會(huì)高速發(fā)展，食品原材料和能源等問題越來越受到世界人民的關(guān)注，纖維素是自然界中含量最多，最豐富的材料，如何利用這一巨大的資源成為研究者最為關(guān)心的問題。最早美國進(jìn)行纖維素材料降解防護(hù)問題時(shí)發(fā)現(xiàn)纖維素經(jīng)微生物降解后，可產(chǎn)生經(jīng)濟(jì)、豐富的生產(chǎn)原料，在擴(kuò)大食品工業(yè)原料和植物原料的綜合利用，提高原料利用率，凈化環(huán)境和開辟新能源等方面具有十分重要的意義，且有望解決自然界不斷產(chǎn)生的固體廢物問題，于是纖維素酶得到了廣泛的關(guān)注。纖維素酶在動(dòng)物飼料、紡織、食品加工、污水處理、中草藥有效成分提取等行業(yè)得到廣泛應(yīng)用，有效地改善產(chǎn)品質(zhì)量，提高產(chǎn)量，具有良好的經(jīng)濟(jì)效益[1-3]。

目前纖維素酶的研究主要集中在菌種的篩選，單一基因的克隆與表達(dá)，及利用分子技術(shù)對(duì)已研究的纖維素酶進(jìn)行合理化和非合理化突變，以期望得到高酶活的基因。W ilson等[4]利用定點(diǎn)突變技術(shù)對(duì)T.fusca的內(nèi)切葡萄糖苷酶Cel6A進(jìn)行突變，獲得了15個(gè)表面突變體和5個(gè)環(huán)突變體，使其對(duì)羧甲基纖維素的活性提高了175%。當(dāng)前研究對(duì)于纖維素酶的整體沒有一個(gè)總的認(rèn)識(shí)，纖維素酶是由三大酶類組成，它們是一個(gè)有機(jī)的整體，才能對(duì)纖維素有一個(gè)很好的降解作用[4-7]，如何使其能夠共同表達(dá)，目前在大腸桿菌中其他基因的共表達(dá)已有的相關(guān)研究，如龐永奇等[8]將pET30a2Cre和pET23b2loxGFP在大腸桿菌中成功實(shí)現(xiàn)了不相容性共表達(dá)；范立強(qiáng)等[9]肉堿脫水酶基因caiB和輔酶合成因子基因caiE的共表達(dá)研究中，比較了相容和不相容表達(dá)系統(tǒng)，基于以前研究基礎(chǔ)，本研究以實(shí)驗(yàn)室自主得到的β-葡萄糖苷酶基因和內(nèi)切葡聚糖苷酶基因出發(fā)，構(gòu)建了這兩種纖維素酶在大腸桿菌中的共表達(dá)，以期能提高降解纖維素的能力。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

本實(shí)驗(yàn)所用的菌株與載體 列于表1；限制性內(nèi)切酶BglⅡ、Bam HⅠ、XhoⅠ、T4DNA連接酶、SlutionⅠ連接酶、DNAMarker、protein Marker（Low）、高保真酶primeSTAR@HSDNA polymerase、氨芐青霉素鈉 大連TaKaRa Biotech公司；質(zhì)粒提取試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒和PCR產(chǎn)物純化回收試劑盒 上海OMEGA生物技術(shù)有限公司；2×PCR master m ix 天根生化科技有限公司；引物 由上海Invitrogen生物技術(shù)有限公司合成；胰蛋白陳和酵母粉 Oxoid公司；SDS-PAGE凝膠試劑盒 武漢博士德生物公司；Ni-Agarose His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒 GE公司美國；其他生物試劑 均為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純。

PCR儀（百樂T100）、GenePulser電穿孔儀（bio-rad Gene PulserMXcellTM）、UVP凝膠成像儀（LY-B）、恒壓恒流電泳儀（DYY-Ⅱ） 北京六一；冷凍離心機(jī)（Avanti J-E） Beckman公司等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建 根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室自行克隆得到的內(nèi)切葡聚糖酶基因EG，并連于pUC18的基因序列pUC18-End和外切葡聚糖酶基因BGL并連于pMD19的基因序列pMD19-BGL，分別進(jìn)行生物信息學(xué)分析，設(shè)計(jì)出不含有信號(hào)肽的引物序列，并在5’端和3’端分別引入了相應(yīng)的酶切位點(diǎn)，引物序列及引入的酶切位點(diǎn)見表2。

高保真酶PCR擴(kuò)增體系：EG基因片段，模板為質(zhì)粒pUC18-End，擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性2m in；94℃變性1min，55℃退火1min，72℃延伸2min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸8m in。BGL基因片段，模板為質(zhì)粒pMD19-BGL，擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性4m in；94℃變性50s，61℃退火50s，72℃延伸3m in，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10m in。產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)回收，之后將PCR產(chǎn)物和表達(dá)載體質(zhì)粒pET32a和pET30b進(jìn)行相應(yīng)的雙酶切，回收后分別進(jìn)行連接：pET32a與EG相連接；pET30b與BGL相連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH 5α，經(jīng)抗性篩選、菌落PCR、酶切篩選后挑取陽性轉(zhuǎn)化子，測(cè)序。結(jié)果正確的重組子命名為：pET32a-EG和pET30b-BGL。

1.2.2 重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化 pET32a-EG和pET30b-BGL分別用熱激法轉(zhuǎn)化入大腸桿菌表達(dá)菌株BL21（DE3），作為對(duì)照，同時(shí)將pET32a-EG和pET30b-BGL等量混合后進(jìn)行電擊轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21（DE3）進(jìn)行電擊共轉(zhuǎn)化，電擊轉(zhuǎn)化程序：電脈沖為25μF，電壓2.5kV，電阻200Ω，時(shí)間4～5ms。pET32a-EG轉(zhuǎn)化子用100mg/L氨芐青霉素（Amp）；pET30b-BGL轉(zhuǎn)化子用50mg/L卡那霉素（Kan）；共轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化子經(jīng)同時(shí)含有Amp和Kan的雙抗生素LB平板上篩選單菌落，37℃過夜培養(yǎng)后，挑取單菌落進(jìn)行菌落PCR鑒定。

1.2.3 重組菌株的菌落PCR及高酶活菌株的篩選 將經(jīng)相應(yīng)抗生素篩選后的轉(zhuǎn)化子，分別轉(zhuǎn)入到另一個(gè)新鮮的帶有相應(yīng)抗性的平板上，37℃過夜培養(yǎng)后，利用T7引物進(jìn)行菌落PCR鑒定。分別挑取10株鑒定結(jié)果為陽性的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行終濃度1mmol/L IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，收集菌體用1/15mol/L的PBS重懸，超聲破碎后，用上清經(jīng)適當(dāng)稀釋后測(cè)酶活。

1.2.4 酶活力測(cè)定方法

表1 本實(shí)驗(yàn)所用的菌株與載體Table1 The strains and vectors used in this experiment

表2 本實(shí)驗(yàn)中所用到的引物序列Table2 Sequences of primers used in this experiment

1.2.4.1 內(nèi)切葡聚糖酶活力測(cè)定方法 以1m L 1%的羧甲基纖維素鈉（用1/15mol/L pH6.8磷酸鹽緩沖液配制）為底物，加入0.1m L粗酶液，50℃水浴反應(yīng)30m in后，加入2.5m L DNS顯色液，沸水浴煮10m in，取出后在流水下迅速冷卻后定容至5.0m L搖勻，將滅活的酶液作為空白對(duì)照，其他同以上步驟。在530.0nm波長(zhǎng)處測(cè)得各管溶液的吸光值[5，10]。

酶活的定義：1m L酶液每分鐘產(chǎn)生1μg還原糖的酶量作為1個(gè)酶活單位，用U/m L表示。

1.2.4.2 β-葡聚糖酶活力測(cè)定方法 加入0.5m L一定稀釋度的粗酶液，以0.5m L 0.5%的水楊苷為底物，加入0.5m L一定稀釋酶液，于55℃反應(yīng)20m in，加入1m L DNS試劑，充分混合在沸水中煮沸5min，冷卻后用蒸餾水定容至5m L，在540nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度，以加熱滅活的酶液為對(duì)照。根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算酶反應(yīng)體系釋放的還原糖的量[6，11]。

酶活定義：1m L酶液在1m in內(nèi)使底物產(chǎn)生1μg還原糖（以葡萄糖計(jì)）所需的酶量為1個(gè)酶活單位（U）。

1.2.4.3 共表達(dá)酶活力測(cè)定方法 共表達(dá)酶活以內(nèi)切葡聚糖酶方法進(jìn)行。

1.2.5 蛋白的分離純化 誘導(dǎo)表達(dá)的發(fā)酵液經(jīng)離心收集菌體，按每100mg菌體（濕重）加入1～5m L細(xì)菌裂解液，經(jīng)超聲裂解菌體后，10000r/min，4℃離心3min，收集上清用GE公司生產(chǎn)的預(yù)裝Ni+柱，用10倍柱體積濃度為50mmol/L的咪唑進(jìn)行平衡后，上樣后用15倍柱體積濃度為500mmol/L的咪唑進(jìn)行洗脫，每1m L收集一管，留樣進(jìn)行SDS-PAGE分析。

1.2.6 重組酶酶學(xué)性質(zhì)分析 最適反應(yīng)pH將酶在pH3.0～10的底物中進(jìn)行測(cè)定，pH穩(wěn)定性分析將酶經(jīng)pH 3.0～10的緩沖液中30m in后采用標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定酶活力，最適反應(yīng)溫度將酶液置于30～90℃反應(yīng)后采用標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定酶活力，熱穩(wěn)定性的測(cè)定將酶液置于30～90℃下保溫30min，采用標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定酶活力，以最高酶活作為100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

以pUC18-End質(zhì)粒和pMD19-BGL為模板用高保真酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得的片斷大小分別約為1500bp和2800bp，與預(yù)計(jì)大小一致，克隆連接入表達(dá)載體，經(jīng)抗性篩選和菌落PCR鑒定后，提取質(zhì)粒采用相應(yīng)的酶進(jìn)行雙酶切分析。pET32a-EG質(zhì)粒，用Bam HⅠ和XhoⅠ酶處理，電泳結(jié)果如圖1所示，酶切過后的載體和目的基因片段大小正確分別為1500bp和5600bp，表達(dá)載體pET32a-EG構(gòu)建成功。

圖1 重組表達(dá)載體pET32a-EG的酶切電泳Fig.1 Restriction analysis of recombinant plasmid pET32a-EG

pET30b-BGL，用BglⅡ和XhoⅠ進(jìn)行單、雙酶切鑒定，電泳檢測(cè)結(jié)果如圖2所示。

圖2 重組表達(dá)載體pET30b-BGL的酶切電泳Fig.2 Restriction analysis of recombinant plasmid pET30b-BGL

重組質(zhì)粒經(jīng)BglⅡ和XhoⅠ分別單酶切之后的目的條帶大小與預(yù)計(jì)大小一致，酶切條帶單一。經(jīng)BglⅡ和XhoⅠ雙酶切之后，目的基因片段與載體分離，目的基因片段大小和載體大小均正確，確定目的基因和載體連接成功。

2.2 共表達(dá)菌株的菌落PCR篩選

將構(gòu)建好的內(nèi)切葡聚糖酶基因表達(dá)載體和外切葡聚糖酶基因表達(dá)載體通過電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入BL21菌株中，經(jīng)（含Amp 100μg/m L和Kan 50μg/m L）雙抗篩選后，得到的陽性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行菌落PCR鑒定，以T7up和T7down為引物，PCR擴(kuò)增結(jié)果如圖3所示，兩條帶大小分別為1500bp和2800bp。

圖3 菌落PCRFig.3 Colony PCR identification

2.3 重組工程菌的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)篩選

分別從相應(yīng)抗性的平板上各挑取10個(gè)陽性轉(zhuǎn)化子，經(jīng)終濃度為1mmol/L IPTG誘導(dǎo)后，測(cè)酶活。測(cè)得酶活如表3所示，從表中分析結(jié)果可知，共轉(zhuǎn)化菌株酶活最高的是2號(hào)，酶活可達(dá)到1196.8U/m L，將其命名為pET32a-EG-pET30b-BGL；pET30b-BGL重組轉(zhuǎn)化菌株酶活最高是5號(hào)，酶活可達(dá)到219.6U/m L，命名為pET30b-BGL；pET32a-EG重組轉(zhuǎn)化菌株酶活最高的是10號(hào)，酶活可達(dá)到826.5U/m L，命名為pET32a-EG。

2.4 蛋白的分離純化SDS-PAGE分析

分別對(duì)篩選出三種酶活較高的基因工程菌pET32a-EG-pET30b-BGL、pET30b-BGL、pET32a-EG的細(xì)胞裂解物進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳分析，如圖4所示，5號(hào)和6號(hào)都出現(xiàn)一條帶，相對(duì)分子量大約為55ku或90ku，7號(hào)出現(xiàn)兩條帶，相對(duì)分子量大約為55ku和90ku，與理論計(jì)算大小相符，結(jié)果表明內(nèi)切葡聚糖酶和β葡萄糖苷酶在大腸桿菌中共同得到高效表達(dá)。1號(hào)和2號(hào)是含空載體大腸桿菌的細(xì)胞裂解物中，不存在目的條帶，與預(yù)期結(jié)果相符。

表3 三種酶活性比較Table3 Enzymatic activity comparison of three enzyme

圖4 三種酶表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析Fig.4 SDS-PAGE analysis of expression of three reconstructed enzyme

蛋白質(zhì)的分離純化方法參照Ni2+柱純化操作方法純化后，得到單一的條帶，條帶大小也與目的蛋白大小預(yù)期一致，分別為55ku和90ku，如圖5所示。

圖5 純化后目的蛋白SDS-PAGEFig.5 SDS-PAGE analysis of purification protein

2.5 重組酶酶學(xué)性質(zhì)分析

2.5.1 重組酶最適反應(yīng)pH測(cè)定 取適當(dāng)稀釋的純化后的酶液在不同pH條件下與底物共同反應(yīng)30m in后，測(cè)定其酶活，結(jié)果如圖6所示，重組共表達(dá)酶（pET32a-EG-pET30b-BGL）、重組內(nèi)切葡聚糖酶（pET32a-EG）和重組β-葡萄糖苷酶（pET30b-BGL）的最適反應(yīng)pH均為6.0，在pH為6.0的環(huán)境下，三種重組酶均能達(dá)到最大酶活力。

圖6 三種酶的最適反應(yīng)pHFig.6 pH profile of the three reconstructed enzyme

圖7 三種酶的pH穩(wěn)定性Fig.7 pH stability of the three reconstructed enzyme

2.5.2 重組酶pH穩(wěn)定性的測(cè)定 取適當(dāng)稀釋的酶液在不同pH下處理后采用標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定其酶活結(jié)果如圖7所示，共表達(dá)酶（pET32a-EG-pET30b-BGL）在pH 5～7之間較為穩(wěn)定，能保持最高酶活的80%以上，β-葡萄糖苷酶（pET30b-BGL）在pH偏酸性的環(huán)境中較為穩(wěn)定，在pH4～6的環(huán)境中處理后，其殘余酶活力仍能保持最高酶活的80%。內(nèi)切葡聚糖酶（pET32a-EG）在pH5～9酶活力相對(duì)穩(wěn)定，可以保持在最高酶活的80%以上。

2.5.3 重組酶最適溫度測(cè)定 取適當(dāng)稀釋的酶液不同的溫度下與底物共同反應(yīng)30m in后，測(cè)定其酶活，結(jié)果如圖8所示，重組共表達(dá)酶（pET32a-EG-pET30b-BGL）、重組內(nèi)切葡聚糖酶（pET32a-EG）的最適反應(yīng)溫度均為60℃，重組β-葡萄糖苷酶（pET30b-BGL）的最適反應(yīng)溫度為50℃，在最適反應(yīng)pH為6.0的環(huán)境下，三種重組酶在各自的最適反應(yīng)溫度下均能達(dá)到最大酶活力。

圖8 三種酶的最適反應(yīng)溫度Fig.8 Optimal temperature of the three reconstructed enzyme

2.5.4 重組酶溫度穩(wěn)定性測(cè)定 取適當(dāng)稀釋的酶液在不同的溫度下處理后，采用標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定其酶活，結(jié)果如圖9所示，共表達(dá)酶共表達(dá)酶（pET32a-EG-pET30b-BGL）和內(nèi)切葡聚糖酶（pET32a-EG）在30～60℃范圍內(nèi)穩(wěn)定性良好，β-葡萄糖苷酶（pET30b-BGL）在30～50℃穩(wěn)定性良好，隨著溫度的逐漸升高，超過50℃，β-葡萄糖苷酶（pET30b-BGL）酶活急劇下降，60℃時(shí)酶活僅為最高酶活的10%，溫度高于80℃時(shí)共表達(dá)酶和內(nèi)切葡聚糖酶酶活迅速下降。

圖9 三種酶熱穩(wěn)定性分析Fig.9 Heat stability of the three reconstructed enzyme

3 討論

隨著基因克隆技術(shù)的飛速發(fā)展，許多外源基因在不同的表達(dá)載體中進(jìn)行表達(dá)，但是，很多生物學(xué)功能并不是由一個(gè)基因或一種蛋白來控制和完成的，它需要多個(gè)相關(guān)基因或蛋白的共同作用[12-14]。比如纖維素酶，就是有三種酶共同作用來分解纖維素的，因此，研究多個(gè)外源基因在同一宿主細(xì)胞中的共表達(dá)具有現(xiàn)實(shí)的意義和重要的應(yīng)用價(jià)值。雙質(zhì)粒共表達(dá)系統(tǒng)是將兩個(gè)外源基因，分別構(gòu)建到不同抗性的載體中，然后把兩個(gè)載體通過電轉(zhuǎn)化法整合到大腸桿菌中，實(shí)現(xiàn)共表達(dá)[8，15-16]。主要分為兩種，一種是復(fù)制子相同的不相容性雙質(zhì)粒，另一種是復(fù)制子不同的相容性雙質(zhì)粒。由于目前較難找到復(fù)制子不相同的兩種載體，因此復(fù)制子相同的不相容雙質(zhì)粒系統(tǒng)操作更加簡(jiǎn)便，更具有實(shí)用性[9，14]。楊巍等[14]利用不相容雙質(zhì)粒系統(tǒng)，將DNA撕裂因子的2個(gè)亞基DFF45和DFF40基因利用不同抗性不相容雙質(zhì)粒系統(tǒng)在大腸桿菌BL21（DE3）中進(jìn)行了共表達(dá)。范立強(qiáng)等[9]在關(guān)于大腸桿菌肉堿脫水酶基因caiB及其輔酶合成因子基因caiE的共表達(dá)研究中，對(duì)相容和不相容這2種雙質(zhì)粒系統(tǒng)進(jìn)行了比較，結(jié)果證明了2種相容質(zhì)粒和不相容質(zhì)粒都能共存于宿主細(xì)胞中，其轉(zhuǎn)化子的數(shù)量相近；同時(shí)證明了含相容質(zhì)粒菌體的存活率的不恒定性，不相容雙質(zhì)粒系統(tǒng)成功因素主要有有質(zhì)粒選擇、轉(zhuǎn)化和培養(yǎng)時(shí)間，對(duì)于質(zhì)粒的選擇，既要考慮抗性的不同，還要保證外源基因能高效表達(dá)，因此還要為基因工程的下游研究打好基礎(chǔ)[17-20]。

本實(shí)驗(yàn)采用的是不相容雙質(zhì)粒表達(dá)系統(tǒng)，分別構(gòu)建好pET32a-EG和pET30b-BGL，然后通過電擊轉(zhuǎn)化法，將構(gòu)建好的兩種重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到制備好的感受態(tài)細(xì)胞中，通過氨芐和卡那這兩種抗生素進(jìn)行雙抗篩選，在雙抗的脅迫下，使其兩種不相容質(zhì)粒在同一宿主菌中穩(wěn)定存在，使兩個(gè)外源基因在大腸桿菌中首次實(shí)現(xiàn)了共同表達(dá)，其酶活為1196.8U/m L，比單一酶組分的酶活力要高，通過酶學(xué)性質(zhì)分析顯示共表達(dá)酶的最適反應(yīng)pH為6.0，最適反應(yīng)溫度60℃，在pH5～7范圍區(qū)間內(nèi)能保持較高的pH穩(wěn)定性，能夠達(dá)到最高酶活的80%以上。在30～60℃范圍能有較高的溫度穩(wěn)定性，酶活維持在80%以上。這一結(jié)果符合纖維素酶的協(xié)同學(xué)說，內(nèi)切葡聚糖酶主要作用于纖維素的非結(jié)晶區(qū)，從還原端或非還原端切下纖維二糖，β-葡聚糖苷酶水解纖維二糖成二個(gè)葡萄糖。在本研究中，共表達(dá)產(chǎn)生的兩種纖維素酶，內(nèi)切葡聚糖酶和β-葡聚糖苷酶在對(duì)可溶性底物羧甲基纖維素鈉降解過程中，纖維二糖的生成累積，被β-葡聚糖苷酶降解成了葡萄糖，使得纖維二糖對(duì)內(nèi)切葡聚糖酶的一個(gè)反抑制作用減弱了，這就使得其能持續(xù)穩(wěn)定地降解[5-7]。從而使酶活力發(fā)揮最大作用。這一研究結(jié)果將具有重大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和工業(yè)應(yīng)用價(jià)值，同時(shí)為纖維素酶共表達(dá)的進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究利用pET32a和pET30b兩個(gè)載體的不同抗性的特性，在大腸桿菌中將β-葡萄糖苷酶基因和內(nèi)切葡聚糖苷酶基因，實(shí)現(xiàn)了不相容性共表達(dá)，獲得了產(chǎn)兩種酶的工程菌，酶活力可達(dá)1196.8U/m L。比單一酶組分的酶活力高，酶學(xué)性質(zhì)分析顯示共表達(dá)酶的最適反應(yīng)pH為6.0，最適反應(yīng)溫度60℃，在pH 5～7范圍內(nèi)能保持較高活性，酶活可達(dá)最高酶活的80%以上。在30～60℃范圍能有較高的溫度穩(wěn)定性，酶活維持在80%以上。這一結(jié)果將為工業(yè)應(yīng)用的進(jìn)一步研究提供理論基礎(chǔ)。

[1]宋京城，蔡健.纖維素酶在食品工業(yè)中的應(yīng)用[J].農(nóng)產(chǎn)品加工·學(xué)刊，2010（3）：69-71.

[2]張明霞，段長(zhǎng)青，張文娜.纖維素酶在食品工業(yè)中的應(yīng)用與展望[J].釀酒科技，2005（4）：99-100.

[3]閆訓(xùn)友，史振霞，張惟廣，等.纖維素酶在食品工業(yè)中的應(yīng)用進(jìn)展[J].食品工業(yè)科技，2004，25（10）：140-142.

[4]Escovar-Kousen JM，Wilson D，Irwin D.Integration of computermodelingand initialstudiesofsite-directedmutagenesis to improve cellulase activity on Cel9A from Thermobifida fusca [J].Appl Biochem Biotechnol，2004，113-116：287-297.

[5]高培基.纖維素酶降解機(jī)制及纖維素酶分子結(jié)構(gòu)與功能研究進(jìn)展[J].自然科學(xué)進(jìn)展，2003，13（1）：21-29.

[6]Parker A，Maw B，F(xiàn)edor L.The beta-glucuronidase catalyzed hydrolysis of a glucopyranosiduronamide and a glucopyranoside：evidence for the oxocarbonium ion mechanism for bovine liver beta-glucuronidase[J].Biochem Biophys Res Commun，1981，103（4）：1390-1394.

[7]Churilova IV，Maksimov VI，Klesov AA.Cellobiose as a regulator of endoglucanase activity of cellulase complexes.Mechanism of the regulation[J].Biokhimiia，1979，44（11）：2100-2102.

[8]龐永奇，賈洪革，方榮祥，等.利用不相容質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化大腸桿菌對(duì)Cre重組酶體內(nèi)重組活性的可視檢測(cè)[J].微生物學(xué)報(bào)，2005，45（1）：125-128.

[9]范立強(qiáng)，袁勤生，吳祥甫.不相容雙質(zhì)粒共表達(dá)大腸桿菌肉堿脫水酶基因caiB及其輔因子合成酶基因caiE[J].中國醫(yī)藥工業(yè)雜志，2002，33（3）：104-108.

[10]吳振芳，陳惠，曾民，等.內(nèi)切葡聚糖酶基因在畢赤酵母中高效表達(dá)研究[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2009，17（3）：529-535.

[11]朱龍寶，湯斌，陶玉貴，等.黑曲霉β-葡萄糖苷酶基因克隆及在畢赤酵母中分泌表達(dá)[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2012，31（9）：973-977.

[12]Sun J，Phillips CM，Anderson CT，et al.Expression and characterization of the Neurospora crassa endoglucanase GH5-1 [J].Protein Expr Purif，2011，75（2）：147-154.

[13]Sommer B，F(xiàn)riehs K，F(xiàn)laschel E.Efficient production of extracellular proteinswith Escherichia coli bymeans ofoptimized coexpression of bacteriocin release proteins[J].J Biotechnol，2010，145（4）：350-358.

[14]楊巍，張嵐，盧智剛.利用兩種不相容質(zhì)粒在大腸桿菌中共表達(dá)DFF45和DFF40[J].生物化學(xué)與生物物理學(xué)報(bào)，2001，33：238-242.

[15]孫劍，王健琪，翟朝陽.不相容雙質(zhì)粒共表達(dá)人內(nèi)皮抑素及簡(jiǎn)化人纖溶酶原餅環(huán)區(qū)5[J].四川大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，37（6）：839-843.

[16]Ervin SE，Small PA Jr，Gulig PA.Use of incompatible plasmids to control expression of antigen by Salmonella typhimurium and analysis of immunogenicity in mice[J].Microb Pathog，1993，15（2）：93-101.

[17]鐘聲，劉丹平，劉素偉，等.血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子121和骨形態(tài)蛋白2雙基因共表達(dá)重組腺病毒載體的構(gòu)建及鑒定[J].中國組織工程研究與臨床康復(fù)，2011，15（20）：3741-3744.

[18]王彥，吳奎，畢玉田，等.FasL和Der p2雙基因共表達(dá)真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其在樹突狀細(xì)胞中的表達(dá)[J].重慶醫(yī)學(xué)，2010，39（20）：2697-2703.

[19]Cheng CY，Yu YJ，Yang MT.Coexpression of omega subunit in E.coli is required for themaintenance of enzymatic activity of Xanthomonas campestris pv.campestris RNA polymerase[J].Protein Expr Purif，2010，69（1）：91-98.

[20]Wang F，Qu H，Zhang D，etal.Production of1，3-propanediol from glycerolby recombinant E.coli using incompatible plasmids system[J].Mol Biotechnol，2007，37（2）：112-119.