高壓二氧化碳對(duì)鮮榨梨汁殺菌效果及動(dòng)力學(xué)研究

廖紅梅，丁占生，鐘 葵，龍飛翊，廖小軍

（1.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無錫214122；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，北京100193；3.瀏陽市質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)及計(jì)量檢定所，湖南瀏陽410300；4.國(guó)家果蔬加工工程技術(shù)研究中心，北京100083）

鮮榨梨汁具有清新的天然風(fēng)味和較高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，含有多種人體必需氨基酸、維生素及豐富的礦物質(zhì)。梨汁可以清熱解毒、平喘止咳，深受人們歡迎[1]。但鮮榨梨汁中含有許多微生物，易引起腐敗變質(zhì)，需要通過殺菌處理以達(dá)到保質(zhì)目的。

高壓二氧化碳（High pressure carbon dioxide，HPCD）技術(shù)是一項(xiàng)具有極大潛力的新型殺菌技術(shù)。前期大量研究將HPCD應(yīng)用到成分單一的液態(tài)媒介中，例如各種培養(yǎng)基、緩沖液和生理鹽水。隨著研究深入，逐漸將其應(yīng)用到成分復(fù)雜的食品體系，主要是各種果蔬汁、牛奶和啤酒等。例如，Parton等[2]采用多批間歇式HPCD處理系統(tǒng)（multi-batch apparatus）對(duì)梨汁中釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）進(jìn)行殺菌，在9MPa，32℃或38℃下處理24m in釀酒酵母降低了6.53個(gè)對(duì)數(shù)。Liao等[3]采用間歇式HPCD處理系統(tǒng)對(duì)蘋果濁汁中大腸桿菌（Escherichia coli）進(jìn)行殺菌，在30MPa，42℃下處理75m in能使其中大腸桿菌降低7.6個(gè)對(duì)數(shù)，達(dá)到完全滅菌。但這些研究主要是針對(duì)在各種液態(tài)體系中接入單一種類微生物，僅有少量研究涉及到食品體系中的自然微生物群[4]。已有研究包括對(duì)橙汁[5-6]、葡萄汁[4，7]、蘋果汁[8]和荔枝汁[9]中細(xì)菌菌落總數(shù)、霉菌和酵母總數(shù)的殺菌效果研究。目前還沒有采用HPCD對(duì)鮮榨梨汁中自然微生物進(jìn)行殺菌處理的研究。

本文以鮮榨梨汁為原料，研究HPCD技術(shù)對(duì)梨汁中細(xì)菌菌落總數(shù)的影響，并采用Weibull分析HPCD殺菌動(dòng)力學(xué)過程，旨在為HPCD在鮮榨梨汁中的應(yīng)用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鴨梨 市售新鮮鴨梨；營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基 北京奧博星科技有限公司。

高壓二氧化碳裝置 江蘇華安科研儀器有限公司；ZDX-35BI型座式自動(dòng)電熱壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠；DHP-9082型電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司；SW-CJ-1FD型無菌操作臺(tái) 蘇州尚田潔凈技術(shù)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 鴨梨汁的制取 市售新鮮鴨梨，清水清洗表皮、切成1cm3小塊，立即用0.3%抗壞血酸護(hù)色液浸泡并榨汁，隨后采用四層紗布（相當(dāng)于200目絹布）過濾。取得梨汁混勻后于4℃冷藏備用，冷藏時(shí)間不超過8h。

1.2.2 高壓二氧化碳處理鴨梨汁 取出在4℃冷藏的鮮榨梨汁（初始細(xì)菌菌落總數(shù)為102～103CFU/m L），在無菌操作臺(tái)中無菌操作量取25m L梨汁于已滅菌的50m L塑料離心管中，每個(gè)處理準(zhǔn)備3個(gè)離心管，共75m L。立即將分裝好的樣品置于已經(jīng)預(yù)熱好的高壓二氧化碳處理釜中。密閉處理釜后進(jìn)行升壓，達(dá)到設(shè)定壓強(qiáng)后進(jìn)行保溫、保壓處理一定時(shí)間，緩慢卸壓并將裝有梨汁的離心管取出，放置無菌瓶中在冰箱中冷卻，以備測(cè)定梨汁中細(xì)菌菌落總數(shù)。同時(shí)做熱處理對(duì)照，即在不通入高壓CO2的條件下，采用與HPCD處理一致的溫度、時(shí)間、加樣量條件處理鮮榨梨汁，并測(cè)定其中細(xì)菌菌落總數(shù)。

1.2.3 微生物數(shù)量測(cè)定 采用平板計(jì)數(shù)法測(cè)定微生物數(shù)目。將菌液用0.85%生理鹽水以10倍稀釋法進(jìn)行逐級(jí)稀釋，根據(jù)細(xì)菌數(shù)量選擇合適的稀釋度進(jìn)行逐級(jí)稀釋，吸取連續(xù)3個(gè)不同稀釋度的稀釋樣1.0m L于滅菌平皿中，倒入約15m L營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，搖勻后在（37±0.1）℃條件下培養(yǎng)24h。并記錄菌數(shù)。

殺菌效果采用殘活率對(duì)數(shù)值（LogN/N0）表示，其中：N0為HPCD處理前的初始微生物數(shù)量（CFU/m L）；N為HPCD處理后的微生物數(shù)量（CFU/m L）。

1.2.4 梨汁中微生物殺菌效果動(dòng)力學(xué)模型分析 采用Weibull模型，該模型由Weibull等[10]于1951年提出：

式中：N0為HPCD處理前的初始微生物數(shù)量（CFU/m L）；N為HPCD處理后的微生物數(shù)量（CFU/m L）；a和b分別為比例因子和形狀因子，t為處理時(shí)間。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)三次，數(shù)據(jù)采用方差分析（ANOVA）。數(shù)據(jù)采用Origin 7.5進(jìn)行統(tǒng)計(jì)并繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 HPCD處理中壓強(qiáng)和溫度對(duì)梨汁中細(xì)菌菌落總數(shù)活性的影響

圖1 HPCD處理壓強(qiáng)、溫度對(duì)梨汁中細(xì)菌菌落總數(shù)活性影響Fig.1 Effectof pressure and temperature on inactivation of totalaerobic bacteria in pear juice as exposed to HPCD for 50min

圖1表示HPCD處理中壓強(qiáng)、溫度對(duì)梨汁中細(xì)菌菌落總數(shù)活性的影響。

在相同壓強(qiáng)和處理時(shí)間的條件下，隨處理溫度升高，梨汁中菌落總數(shù)殘存率顯著下降（p＜0.05），表明HPCD處理時(shí)溫度具有協(xié)同殺菌效應(yīng)：在20MPa下處理50m in，溫度分別為20、30和40℃時(shí)，梨汁中細(xì)菌總數(shù)分別降低了0.85、1.11和1.53個(gè)對(duì)數(shù)；在25MPa下處理50min，溫度分別為20、30和40℃時(shí)，梨汁中細(xì)菌總數(shù)分別降低了1.99、2.10和2.26個(gè)對(duì)數(shù)；在30MPa處理50m in，當(dāng)溫度分別為20、30和40℃時(shí)，梨汁中細(xì)菌總數(shù)分別降低了2.26、2.41和2.65個(gè)對(duì)數(shù)。目前關(guān)于處理溫度能協(xié)同增強(qiáng)HPCD殺菌效果的解釋，一方面是，較高的溫度能促進(jìn)CO2的溶解、利于其穿透細(xì)胞膜，從而提高HPCD對(duì)微生物的殺滅效果；另一方面是，處于臨界點(diǎn)附近的溫度改變能使亞臨界狀態(tài)CO2變?yōu)槌R界狀態(tài)，而超臨界狀態(tài)下CO2的溶解度和密度顯著增強(qiáng)，因此臨界點(diǎn)附近的溫度能提高殺滅效果[11]。

由圖1可知，隨著處理壓強(qiáng)升高，梨汁中菌落總數(shù)殘存率顯著下降（p＜0.05）。在30℃條件下處理50m in，當(dāng)處理壓強(qiáng)分別為20、25和30MPa時(shí)，梨汁中細(xì)菌菌落總數(shù)分別降低了1.11、2.10和2.41個(gè)對(duì)數(shù)。這與已有研究結(jié)果一致[12-13]。主要是由于較高的壓強(qiáng)一方面能夠提高CO2滲透性和溶解能力，增加CO2與微生物細(xì)胞內(nèi)部物質(zhì)的接觸；另一方面也提高了對(duì)細(xì)胞的機(jī)械損傷，使微生物細(xì)胞壁和細(xì)胞膜破損而致死[14]。

2.2 HPCD處理時(shí)間對(duì)梨汁中菌落總數(shù)活性的影響

圖2～圖4，為不同溫度、壓強(qiáng)條件下隨著處理時(shí)間延長(zhǎng)，HPCD處理和熱處理對(duì)梨汁中細(xì)菌菌落總數(shù)的殺菌曲線。在40℃條件下處理20min，熱處理和HPCD（30MPa）處理分別使梨汁中細(xì)菌菌落總數(shù)降低了0.08和1.57個(gè)對(duì)數(shù)；當(dāng)處理時(shí)間延長(zhǎng)到60m in時(shí)，熱處理和HPCD（30MPa）處理分別使梨汁中細(xì)菌菌落總數(shù)降低了0.18和2.66個(gè)對(duì)數(shù)。在相同溫度和處理時(shí)間條件下，HPCD處理的殺菌效果顯著高于熱處理殺菌效果（p＜0.05），且隨著處理時(shí)間延長(zhǎng)，二者之間差距顯著增大。說明在HPCD處理過程中，溫度對(duì)其殺菌效果具有協(xié)同效應(yīng)。

圖220℃下HPCD對(duì)鮮榨梨汁中菌落總數(shù)活性影響Fig.2 Inactivation of total aerobic bacteria in pear juice as exposed to HPCD at20℃

圖330℃下HPCD對(duì)鮮榨梨汁中菌落總數(shù)活性影響Fig.3 Inactivation of total aerobic bacteria in pear juice as exposed to HPCD at30℃

圖440℃下HPCD對(duì)鮮榨梨汁中菌落總數(shù)活性影響Fig.4 Inactivation of total aerobic bacteria in pear juice as exposed to HPCD at40℃

壓力和處理時(shí)間是影響HPCD殺菌效果的重要因素。研究表明，隨壓力的增大HPCD對(duì)細(xì)菌的鈍化作用也隨之增強(qiáng)，是因?yàn)閴毫梢钥刂艭O2的溶解速率以及溶解度，增加壓力可以使CO2溶解能力增強(qiáng)，利于HPCD萃取出細(xì)胞內(nèi)生命物質(zhì)，使微生物細(xì)胞破裂死亡[14]。同一溫度下隨處理壓力和處理時(shí)間增加HPCD的殺菌效果顯著增強(qiáng)（p＜0.05）。在20℃處理20m in，當(dāng)壓強(qiáng)由20MPa升高至25MPa、30MPa時(shí)，梨汁中菌落總數(shù)分別下降了0.37和0.79個(gè)對(duì)數(shù)。表明隨壓力增加，殘存率顯著下降（p＜0.05）。這種殺菌效果隨著壓強(qiáng)升高而增強(qiáng)的趨勢(shì)在其他溫度下也很明顯。另一方面，當(dāng)壓力20MPa時(shí)，隨處理時(shí)間增加菌落總數(shù)殘存率下降緩慢，從20m in增加到60m in時(shí)殘存率下降不到0.8個(gè)對(duì)數(shù)，表明殺菌效果較弱。在HPCD處理?xiàng)l件為30MPa、20℃、60m in時(shí)，鮮榨梨汁中自然菌落活菌率降低了2.36個(gè)對(duì)數(shù)（圖2）。

不同溫度下隨著處理壓力和時(shí)間的變化，HPCD的殺菌曲線呈現(xiàn)類似的變化趨勢(shì)。此外，較高溫度時(shí)，隨著處理時(shí)間的進(jìn)一步延長(zhǎng)，梨汁中菌落總數(shù)的下降趨勢(shì)減緩，表現(xiàn)為曲線逐漸變得較為平滑，如40℃、30MPa時(shí)，隨處理時(shí)間從50m in延長(zhǎng)至60m in，微生物殘存率沒有顯著變化（p＞0.05）。其中，在HPCD處理?xiàng)l件為30MPa、40℃、60m in時(shí)，殺菌效果最好，使鮮榨梨汁中菌落總數(shù)的殘存率下降了2.66個(gè)對(duì)數(shù)。

2.3 HPCD對(duì)梨汁中菌落總數(shù)活性影響的動(dòng)力學(xué)分析

表1 Weibull模型分析鮮榨梨汁中菌落總數(shù)殺滅效果的動(dòng)力學(xué)參數(shù)Table1 Estimations of the kinetic parameters and R2 of inactivation of total aerobic bacteria in pear juice using the Weibullmodel

微生物殺菌動(dòng)力學(xué)模型分析是研究殺菌技術(shù)的理論關(guān)鍵之一。利用食品預(yù)測(cè)微生物學(xué)方法和理論，通過研究加工因素、微生物因素和產(chǎn)品因素對(duì)HPCD殺菌過程的影響，建立預(yù)測(cè)模型和回歸方程，能更好地理解HPCD殺菌動(dòng)力學(xué)及機(jī)理，提高其殺菌效果，確保食品安全[15]。果汁飲料中菌落總數(shù)變化的動(dòng)力學(xué)分析和相關(guān)數(shù)學(xué)模型建立，對(duì)非熱加工技術(shù)實(shí)際應(yīng)用具有較好的理論指導(dǎo)意義。在HPCD殺菌研究中，很多學(xué)者采用了一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型來分析殺菌過程。

根據(jù)圖2～圖4的殺菌曲線，本文采用Weibull模型分析和擬合HPCD對(duì)梨汁中菌落總數(shù)殺菌動(dòng)力學(xué)過程。Weibull模型描述ln（N/N0）和處理時(shí)間t之間的相關(guān)性，以ln（N/N0）為y軸，處理時(shí)間t為x軸作圖，采用Origin 7.5進(jìn)行數(shù)據(jù)的模型擬合并得到相關(guān)參數(shù)a和b。通常認(rèn)為a因子是速度常數(shù)，b因子代表失活曲線的形狀。b＜1時(shí)失活曲線時(shí)凹面；b＞1時(shí)是凸面；b=1時(shí)是一條直線，即一級(jí)動(dòng)力學(xué)反應(yīng)[16]。結(jié)果表明（表1），Weibull模型能夠很好地?cái)M合HPCD對(duì)菌落總數(shù)殺滅效果的動(dòng)力學(xué)變化，相關(guān)系數(shù)均在0.9725以上，模型值和實(shí)驗(yàn)值之間數(shù)值之間差異不顯著，表明能較好反映HPCD處理下菌落總數(shù)的失活曲線變化。隨壓力和處理溫度升高，比例因子a逐漸降低，表明隨溫度升高，壓力增大，菌落總數(shù)失活效果更加明顯；b值也呈現(xiàn)變小趨勢(shì)，表明失活曲線的凹面更加明顯，失活動(dòng)力學(xué)不是簡(jiǎn)單的一級(jí)動(dòng)力學(xué)。

圖5 HPCD對(duì)梨汁中菌落總數(shù)殺菌效果Weibull模型預(yù)測(cè)值和實(shí)測(cè)值的比較圖Fig.5 Correlation between the experimental data and the predicted data obtained with themodel

圖5為殺菌效果的實(shí)驗(yàn)值和Weibull模型值比較圖。由圖5可見，Weibull模型預(yù)測(cè)值和實(shí)測(cè)值的數(shù)值之間差異很小，相關(guān)系數(shù)R2都大于0.97，表明Weibull模型擬合度很高，能較好的反映HPCD處理下菌落總數(shù)的失活曲線變化。

3 結(jié)論

隨著處理溫度升高，梨汁中細(xì)菌菌落總數(shù)顯著降低（p＜0.05）；在相同溫度和處理時(shí)間條件下，HPCD處理的殺菌效果顯著高于熱處理殺菌效果，處理溫度對(duì)HPCD殺菌效果具有協(xié)同效應(yīng)；隨著壓強(qiáng)升高、處理時(shí)間延長(zhǎng)，HPCD對(duì)梨汁中細(xì)菌菌落總數(shù)的殺菌效果顯著增強(qiáng)（p＜0.05）；當(dāng)HPCD處理?xiàng)l件為30MPa、40℃、60m in時(shí)，滅菌效果最佳，梨汁中細(xì)菌菌落總數(shù)的殘存率降低了2.66個(gè)對(duì)數(shù)。

Weibull模型能較好地?cái)M合HPCD處理后梨汁中細(xì)菌菌落總數(shù)的失活曲線，隨壓力增加和溫度升高，模型動(dòng)力學(xué)參數(shù)比例因子a和形狀因子b呈現(xiàn)逐漸變小的規(guī)律性變化。

[1]胡長(zhǎng)海，丁元?jiǎng)P.梨汁的酶法保鮮[J].遼寧工學(xué)院學(xué)報(bào)，1997，17（4）：85.

[2]Parton T，Elvassore N，Bertucco A，et al.High pressure CO2inactivation of food：Amulti-batch reactor system for inactivation kinetic determination[J].Journalof Supercritical Fluids，2007，40：490-496.

[3]Liao H M，Zhang Y，Hu X S，et al.Behavior of inactivation kinetics of Escherichia coli by dense phase carbon dioxide[J].International Journal of Food Microbiology，2008，126：93-97.

[4]Parton T，Bertucco A，Bertoloni G.Pasteurisation of grape must and tomato paste by dense-phase CO2[J].Italian Journal of Food Science，2007，19（4）：425-437.

[5]Arreola AG，Balaban M O，WeiCI，etal.Effectof supercritical carbon dioxide onmicrobial populations in single strength orange juice[J].Journal of Food Quality，1991，14（4）：275-284.

[6]Yagiz Y，Lim S L，Balaban M O.Continuous high pressure CO2processing ofmandarin juice[C].IFTAnnual Meeting Book of Abstracts，2005-07.

[7]Del Pozo-Insfran D，Balaban M O，Talcott S T.Microbial stability，phytochemical retention，and organoleptic attributes of dense phase CO2processed muscadine grape juice[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，2006，54（15）：5468-5473.

[8]Liao H M，Zhang L Y，Hu X S，et al.Effect of high pressure CO2and mild heat processing on natural microorganisms in apple juice[J].International Journal of Food Microbiology，2010，137（1）：81-87.

[9]Li H，Zhao L，Wu J H，et al.Inactivation of natural microorganisms in litchi juice by high-pressure carbon dioxide combined with mild heat and nisin[J].Food Microbiology，2012，30（1）：139-145.

[10]Weibull W A.Statistical distribution function of wide applicability[J].Journal of Applied Mechanics，1951，51：293-297.

[11]Garcia-Gonzalez L，Geeraerd A H，Spilimbergo S，et al.High pressure carbon dioxide inactivation of microorganisms in foods：The past，the presentand the future[J].International Journal of Food Microbiology，2007，117（1）：1-28.

[12]Ferrentino G，Balaban M O，F(xiàn)errari G，et al.Food treatment with high pressure carbon dioxide：Saccharomyces cerevisiae inactivation kinetics expressed as a function of CO2solubility[J].Journal of Supercritical Fluids，2010，52（1）：151-160.

[13]Bae Y Y，Lee H J，Kim S A，et al.Inactivation of Alicyclobacillus acidoterrestris spores in apple juice by supercritical carbon dioxide[J].International Journal of Food Microbiology，2009，136（1）：95-100.

[14]Damar S，Balaban M O.Review of dense phase CO2technology：microbial and enzyme inactivation，and effects on food quality[J].Journal of Food Science，2006，71（1）：R1-R11.

[15]廖紅梅，成玉梁，廖小軍，等.預(yù)測(cè)微生物學(xué)在高壓二氧化碳?xì)⒕鷦?dòng)力學(xué)的應(yīng)用進(jìn)展[J].食品工業(yè)科技，2012，33（13）：366-372.

[16]Rodrigo D，Ruíz P，Barbosa-Cánovas G V，et al.Kinetic model for the inactivation of Lactobacillus plantarum by pulsed electric fields[J].International Journal of Food Microbiology，2003，81：223-229.