雙酶分步水解制備棉籽多肽工藝條件優(yōu)化

■ 黃 薇 林 虬 宋永康 姚清華

(1.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室，福建福州 350003；2.福建省精密儀器農(nóng)業(yè)測(cè)試重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建福州 350003)

我國(guó)是世界上主要的產(chǎn)棉大國(guó)，棉籽產(chǎn)量約占世界總產(chǎn)量的10%，棉籽蛋白的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值比谷類蛋白高，近似豆類蛋白，是一種理想的植物蛋白質(zhì)資源。但長(zhǎng)期以來，棉籽蛋白因含有棉酚等有毒有害物質(zhì)而使其用途受到局限，未能得到很好的開發(fā)利用。隨著棉酚提取工藝以及無腺棉籽種植的廣泛推廣，棉籽蛋白資源受到了食品工業(yè)和飼料工業(yè)的廣泛關(guān)注，如何進(jìn)一步開發(fā)和利用棉籽蛋白資源成為了當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。

使用生物催化技術(shù)將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化成多肽、寡肽等，已被證實(shí)是開發(fā)利用低值蛋白資源的重要途徑。在對(duì)酶解法生產(chǎn)棉籽多肽的研究中，單酶水解法依舊是當(dāng)前研究的主要方向。但隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)采用雙酶分步水解法可以顯著提高蛋白質(zhì)的水解效率和程度。郭城等研究結(jié)果表明，采用Alcalase水解棉籽蛋白300 min，滅酶后再加入中性蛋白酶AS1.398繼續(xù)作用100 min，水解度可達(dá)20.08%，效果要優(yōu)于單酶水解。

本課題組從6種商品化蛋白酶中篩選出雙酶分步水解法制備高多肽得率的棉籽多肽用蛋白酶Alcalase酶和Flavourzyme酶。在此基礎(chǔ)上，本研究對(duì)雙酶分步水解棉籽蛋白工藝的多種影響因素進(jìn)行了研究，探索出了分步酶解棉籽蛋白的最適工藝參數(shù)，在較短時(shí)間內(nèi)提高棉籽蛋白的多肽得率，為棉籽蛋白多肽的產(chǎn)業(yè)化開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

棉籽蛋白：市售，蛋白含量為37.77%；Alcalase酶：內(nèi)切肽酶活性，酶活力380 000 U/ml，諾維信公司；Flavourzyme酶：內(nèi)切肽酶和外切肽酶兩種活性，酶活力430 000 U/ml，諾維信公司；三氯乙酸（TCA）、氫氧化鈉、鹽酸等其他試劑均為分析純。

1.2 主要設(shè)備

全自動(dòng)凱氏定氮儀（瑞典Foss KIELETEC ANALYSISER），電子分析天平（瑞士METTLER TOLEDO AL204），恒溫磁力攪拌器（國(guó)華企業(yè) HJ-3），恒溫振蕩器（國(guó)華企業(yè) 3HA-C），離心機(jī)（長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī) TD5A-WS），pH酸度計(jì)（上海雷磁PHS-3C）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 棉籽蛋白水解

棉籽蛋白的溶解性較差，水解前對(duì)棉籽蛋白進(jìn)行預(yù)處理能夠顯著提高水解的效果。酶解前首先對(duì)棉籽蛋白進(jìn)行粉碎過篩至60目左右，按試驗(yàn)設(shè)計(jì)配制成一定質(zhì)量濃度的棉籽蛋白質(zhì)溶液，40℃浸提2 h，作為酶反應(yīng)的底物溶液。調(diào)節(jié)反應(yīng)體系達(dá)到Alcalase酶水解條件，進(jìn)行水解一定時(shí)間后，95℃水浴滅酶15 min，再調(diào)pH值、溫度加入Flavourzyme酶繼續(xù)水解至預(yù)定時(shí)間，完畢后滅酶，冷卻。

1.3.2 多肽得率的測(cè)定

對(duì)特定底物而言，三氯乙酸可以定性地反映蛋白質(zhì)的分解情況，溶解指數(shù)越高，表明較短肽鏈的含量也越高。多肽得率采用三氯乙酸可溶性氮法（TCA-SNI）進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.3 Plackett-Burrman設(shè)計(jì)

在前期單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用Plackett-Burman設(shè)計(jì)試驗(yàn)對(duì)影響雙酶分步水解棉籽蛋白的9個(gè)因素進(jìn)行評(píng)估。Plackett-Burman設(shè)計(jì)試驗(yàn)因素水平見表1。

表1 Plackett-Burman設(shè)計(jì)試驗(yàn)因素水平

每個(gè)因素各取低水平（-1）和高水平（+1）兩個(gè)水平，其中X10,X11為估計(jì)誤差而設(shè)置的對(duì)照虛擬因子。

1.3.4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

運(yùn)用Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，對(duì)Plackett-Burman設(shè)計(jì)試驗(yàn)篩選出的關(guān)鍵因素（底物濃度、Alcalase酶反應(yīng)溫度、Flavourzyme酶加酶量）進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，見表2。同時(shí)固定其他非關(guān)鍵因素：Alcalase酶反應(yīng)時(shí)間150 min，Alca?lase酶反應(yīng)pH值8.0，Alcalase酶酶用量25 000 U/g，F(xiàn)lavourzyme酶反應(yīng)時(shí)間120 min，F(xiàn)lavourzyme酶反應(yīng)pH值6.0，F(xiàn)lavourzyme酶反應(yīng)溫度50℃。

表2 響應(yīng)面優(yōu)化的因素和水平設(shè)計(jì)

2 結(jié)果與討論

2.1 Plackett-Burrman設(shè)計(jì)篩選主效因素

以多肽得率(%)為響應(yīng)值，Plackett-Burrman設(shè)計(jì)試驗(yàn)與結(jié)果見表3。對(duì)表中數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得到各影響因子的回歸系數(shù)及其顯著性(見表4)。

從分析結(jié)果中可以看出，主要影響因子為因素 X1(底物濃度)、X5(Alcalase酶反應(yīng)溫度)、X7（Flavourzyme酶加酶量），其貢獻(xiàn)率分別為：50.49%、14.26%和22.74%，且對(duì)多肽得率的影響均達(dá)到顯著水平（P＜0.05）。

表3 Plackett-Burman設(shè)計(jì)試驗(yàn)與結(jié)果

表4 Plackett-Burman設(shè)計(jì)試驗(yàn)方差分析和回歸系數(shù)估計(jì)

方差分析模型的P值為0.040 4，表明所得回歸方程達(dá)到極顯著，整個(gè)回歸區(qū)域擬合較好。復(fù)相關(guān)系數(shù)R2=0.990 9，校正決定系數(shù)Adj R2=0.949 8，表明此回歸模型相關(guān)性好，能解釋94.98%的試驗(yàn)數(shù)據(jù)的變異。模型的信噪比（Adeq precision）為15.467，大于4視為滿意模型，表明該模型為滿意模型。

2.2 Box-Behnken中心組合優(yōu)化設(shè)計(jì)結(jié)果與響應(yīng)面分析

2.2.1 多元二次回歸方程的建立及檢驗(yàn)

對(duì)Plackett-Burrman設(shè)計(jì)篩選出的3個(gè)主效影響因素：底物濃度、Alcalase酶反應(yīng)溫度、Fla?vourzyme酶加酶量，開展N=17的三因素三水平的Box-Behnken的中心組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見表5。利用Design Expert 8.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到雙酶分步水解棉籽蛋白的多項(xiàng)式回歸模型如下：

對(duì)上述模型進(jìn)行回歸系數(shù)顯著性檢驗(yàn)(見表6),式中X1、X2、X3一次項(xiàng)和X1X2、X12、X22、X32的二次項(xiàng)對(duì)多肽得率的影響極顯著，X2X3對(duì)多肽得率的影響顯著。該二次多項(xiàng)模型的P值＜0.000 1，顯示該模型高度顯著；失擬項(xiàng)反映試驗(yàn)數(shù)據(jù)與模型不相符情況，其P值為0.372 0＞0.1，在a=0.1水平上不顯著，說明模型選擇正確；多元相關(guān)系數(shù)為R2=0.981 5，校正決定系數(shù)Adj R2=0.957 8，表明此回歸模型能解釋95.78%響應(yīng)值的變異，說明模型對(duì)實(shí)際情況擬合程度良好；模型的信噪比（Adeq pre?cision）為20.820（＞4），說明本模型的設(shè)計(jì)對(duì)雙酶分步水解棉籽蛋白的條件進(jìn)行優(yōu)化是合適的。

表5 Box-Behnken設(shè)計(jì)矩陣和響應(yīng)數(shù)據(jù)的實(shí)測(cè)值與擬合值

表6 二次多項(xiàng)模型方差分析

2.2.2 響應(yīng)面分析與優(yōu)化

經(jīng)過Design Expert軟件分析，得到各交互因素對(duì)多肽得率的響應(yīng)面曲面圖及其等高線圖，見圖1～圖3。其中等高線的形狀反映出交互效應(yīng)的強(qiáng)弱大小，橢圓形表示兩因素交互作用顯著，而圓形則相反。

圖1 底物濃度和Alcalase酶反應(yīng)溫度交互影響的三維曲面圖和等高線

圖2 底物濃度和Flavourzyme酶加酶量交互影響的三維曲面圖和等高線

圖1顯示了底物濃度與Alcalase酶反應(yīng)溫度對(duì)響應(yīng)值多肽得率的交互影響效應(yīng)。從其等高線圖可以直觀的看出底物濃度與Alcalase酶反應(yīng)溫度的交互作用顯著。在本次試驗(yàn)水平范圍內(nèi)，當(dāng)?shù)孜餄舛葹?.62%，Alcalas酶反應(yīng)溫度為59.3℃時(shí)，多肽得率達(dá)到最大值64.81%。

底物濃度與Flavourzyme酶加酶量對(duì)多肽得率的交互作用見圖2。從等高線的圖形中可以看出兩者交互作用不顯著。當(dāng)?shù)孜餄舛葹?.24%，F(xiàn)lavourzyme酶加酶量約為28 000 U/g，多肽得率可以達(dá)到最大值。

圖3 Alcalase酶反應(yīng)溫度和Flavourzyme酶加酶量交互影響的三維曲面圖和等高線

從圖3中可以看出Alcalase酶反應(yīng)溫度和Fla?vourzyme酶加酶量對(duì)多肽得率的交互作用。由等高線圖可見，該兩因素對(duì)多肽得率的交互作用顯著，當(dāng) Alcalase酶反應(yīng)溫度約為59～60 ℃、Fla?vourzyme酶加酶量約為26 000～27 000 U/g時(shí)，多肽得率可以達(dá)到本試驗(yàn)中的最大值64.50%。

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

根據(jù)Box-Behnken中心組合優(yōu)化設(shè)計(jì)試驗(yàn)所得的結(jié)果和二次多項(xiàng)回歸方程，得到最佳水解條件為底物濃度(w/v)8.36%，Alcalase酶在溫度59.9℃、pH值8.0、酶用量25 000 U/g的條件下水解150 min，再用Flavourzyme酶在溫度50℃、pH值6.0、酶用量27 430 U/g的條件下水解120 min，酶解液的多肽得率可達(dá)到65.07%。為了檢驗(yàn)?zāi)Ｐ皖A(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性，采用上述優(yōu)化后的工藝條件對(duì)棉籽蛋白進(jìn)行水解驗(yàn)證試驗(yàn)，實(shí)測(cè)多肽得率結(jié)果分別為64.88%、64.75%和65.02%，與預(yù)測(cè)值較接近，表明了Plackett-Burrman設(shè)計(jì)和Box-Behnken響應(yīng)面分析法聯(lián)用的可行性以及所得模型能較好地預(yù)測(cè)實(shí)際水解情況。

3 結(jié)語(yǔ)

在試驗(yàn)條件優(yōu)化方面，依靠正交試驗(yàn)或均勻設(shè)計(jì)難以得到較快較好的結(jié)果。響應(yīng)面分析法（Re?sponse Surface Methodology,簡(jiǎn)稱RSM）是一種工藝條件優(yōu)化的有效方法，可用于確定試驗(yàn)因素及其交互作用在工藝過程中對(duì)指標(biāo)響應(yīng)值的影響，精確地表述因素和響應(yīng)值之間的關(guān)系。姜曉嬌等應(yīng)用響應(yīng)面法的Box-Behnken中心組合試驗(yàn)進(jìn)行設(shè)計(jì)，以棉籽多肽產(chǎn)率為響應(yīng)值，對(duì)堿性蛋白酶酶解制備棉籽多肽的條件進(jìn)行了優(yōu)化，優(yōu)化得到的棉籽多肽產(chǎn)率為49.60%。Plackett-Burman（PB）設(shè)計(jì)主要應(yīng)用于微生物發(fā)酵工藝關(guān)鍵參數(shù)的篩選和發(fā)酵培養(yǎng)基成分的優(yōu)化，能夠從眾多操作條件中快速有效的篩選出主效因素，從而減少優(yōu)化過程中的考察因素?cái)?shù)和試驗(yàn)次數(shù)。目前將PB篩選和響應(yīng)面分析聯(lián)合應(yīng)用于棉籽蛋白酶解工藝的優(yōu)化尚未見報(bào)道。

本研究以多肽得率為響應(yīng)值，將PB篩選和RSM分析相結(jié)合成功地應(yīng)用于棉籽蛋白雙酶分步水解的工藝條件優(yōu)化，并確定最佳水解條件為，底物濃度(w/v)8.36%，先用Alcalase酶在溫度59.9℃、pH值8.0、酶用量25 000 U/g的條件下水解150 min，再用Flavourzyme酶在溫度50℃、pH值6.0、酶用量27 430 U/g的條件下水解120 min，在最佳條件下，多肽得率可達(dá)到65.07%。經(jīng)方差分析可知Plack?ett-Burrman設(shè)計(jì)試驗(yàn)篩選得到的關(guān)鍵因子對(duì)棉籽多肽得率的影響都是顯著的，底物濃度與Alcalase酶反應(yīng)溫度以及Alcalase酶反應(yīng)溫度與Fla?vourzyme酶加酶量的交互影響也顯著。驗(yàn)證試驗(yàn)證明，PB篩選和響應(yīng)面分析法可以有效的優(yōu)化雙酶分步水解棉籽蛋白的水解參數(shù)，這對(duì)棉籽肽蛋白的工業(yè)化生產(chǎn)具有一定的指導(dǎo)意義。

（參考文獻(xiàn)19篇，刊略，需者可函索）