飼料添加劑牛至油中香芹酚和百里香酚含量的測定

■竇茂鑫 趙 迪 侯永清 吳 濤

（動物營養(yǎng)與飼料科學(xué)湖北省重點實驗室，湖北武漢 430023）

長期以來，飼料中添加抗生素為集約化畜牧業(yè)的發(fā)展做出重大貢獻的同時也帶來了諸多負面影響，如容易造成仔豬的抗藥性、毒副作用和體內(nèi)殘留及環(huán)境污染等[1]。新型藥物添加劑牛至油，以其綠色、環(huán)保、廣譜抗菌、促生長、無殘留及不易產(chǎn)生耐藥性等特點，在未來養(yǎng)豬業(yè)上的應(yīng)用前景非?？春肹2]。本研究建立了飼料藥物添加劑牛至油中香芹酚和百里香酚的檢測方法，本方法操作簡便、準確可靠、選擇性好，為牛至油的檢測提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗儀器

高效液相色譜儀（Waters 1525型，配Waters 2489檢測器）、超聲波清洗器、電子天平（精度0.000 1 g）。

1.2 試驗試劑

甲醇、冰醋酸為色譜純，試驗用超純水；香芹酚標準品（Sigma公司，純度≥99%），百里香酚標準品（Sigma公司，純度≥99%）。

1.3 色譜條件

色譜柱：Diamonsil C18(2)柱(粒度為5 μm，柱規(guī)格為250 mm×4.5 mm)，流動相：甲醇∶水∶冰醋酸=60∶4∶2，檢測波長：274 nm，流速：1.0 ml/min，進樣體積為20 μl，柱溫30 ℃。

1.4 標準溶液的制備

精密量取香芹酚0.5 ml，置于50 ml容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，制成香芹酚含量為1%的貯備液；精密稱取百里香酚0.5 g，置于50 ml容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，配制成濃度為10 mg/ml的百里香酚貯備液。然后用甲醇將香芹酚貯備液稀釋成含量分別為（×10-3μl/ml）5.0、10.0、50.0、100.0、250.0和500.0的標準液，用甲醇將百里香酚貯備液稀釋成濃度為1.0、5.0、10.0、50.0、100.0、250.0和500.0 μg/ml的標準液。

1.5 樣品溶液的制備

精密量取牛至油樣品0.5 ml置于250 ml容量瓶中，加200 ml甲醇超聲提取30 min，冷卻后用甲醇定容，經(jīng)過0.22 μm濾膜過濾后制供試樣品溶液。

1.6 加樣回收試驗

精密量取5份已知含量的牛至油供試樣品，分別添加已知含量的香芹酚和百里香酚標準品，測定兩者的回收率和精密度。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜圖

標準溶液的色譜圖如圖1所示。圖1表明，香芹酚和百里香酚得到了很好的基線分離，峰形對稱，無雜質(zhì)峰干擾。

圖1 香芹酚和百里香酚標準溶液色譜圖

2.2 標準曲線的測定

將香芹酚和百里香酚一系列濃度的標準品溶液分別取20 μl進樣，測定積分值，以峰面積為縱坐標，分別以香芹酚和百里香酚含量為橫坐標繪制標準曲線，計算回歸方程。

香芹酚：Y=15 123X+22 670 R2=0.999 8；

百里香酚：Y=14 825X-15 883 R2=0.999 4。

結(jié)果表明，香芹酚在5.0～500.0×10-3μl/ml濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，百里香酚在1～500 μg/ml的濃度范圍內(nèi)也呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.3 精密度試驗

分別取0.1 μl/ml的香芹酚標準品溶液和100 μg/ml的百里香酚標準品溶液 20 μl進樣，連續(xù)進樣5次，測定峰面積如表1所示。求得香芹酚和百里香酚峰面積的RSD分別為0.39%和0.82%，說明此方法具有較好的精密度。

表1 香芹酚和百里香酚精密度試驗（峰面積）

2.4 重復(fù)性試驗

牛至油制成的5份牛至油供試樣品中香芹酚含量和百里香酚含量如表2、表3所示。試驗測得香芹酚和百里香酚的平均含量分別為37.81%、7.05 mg/ml，變異系數(shù)分別為0.91%、1.1%，說明方法重現(xiàn)性良好。

表2 牛至油中香芹酚含量測定試驗

表3 牛至油中百里香酚含量測定試驗

2.5 加樣回收試驗

精密量取5份已知含量的牛至油供試樣品5 ml，分別置于5個50 ml容量瓶中，然后分別添加濃度為0.1 μl/ml的香芹酚標準液和50 μg/ml的百里香酚標準液，測得結(jié)果如表4、表5所示。香芹酚和百里香酚的平均回收率分別為98.2%、98.4%，RSD分別為1.0%、1.3%，結(jié)果說明該方法的回收率高。

表4 牛至油中香芹酚回收率測定試驗

表5 牛至油中百里香酚回收率測定試驗

3 討論

牛至油具有抗菌、殺菌功能，因其具有較強的脂溶性和表面活性，與病原微生物的細胞膜有很強的親和力，能使細胞膜的通透性增加，內(nèi)容物流失從而殺滅病原微生物[3]。有研究報道[4-6]，牛至油的主要成分為香芹酚、百里香酚、對聚傘花素等，其中香芹酚和百里香酚抗菌活性最高。本研究建立了飼料藥物添加劑牛至油中香芹酚和百里香酚的檢測方法，本方法操作簡便、準確可靠、選擇性好，可作為控制牛至油質(zhì)量的方法。

本試驗選用甲醇超聲提取30 min，采用Di?amonsil C18(2)柱分離，Waters 2489檢測器檢測，以甲醇-水-冰醋酸（60∶4∶2）為流動相，結(jié)果顯示此方法使香芹酚和百里香酚得到很好的基線分離，且重復(fù)性好、回收率高，可以作為牛至油中香芹酚和百里香酚檢測的標準方法。