人脂肪干細(xì)胞對(duì)大鼠帶真皮下血管網(wǎng)皮片移植的影響

，，，，

(青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院,山東 青島 266003 1 醫(yī)學(xué)美容中心； 2 中心實(shí)驗(yàn)室)

皮片移植是整形和重建手術(shù)的一種重要方法。因受多種因素如受皮區(qū)止血、皮片下積液引流、皮片固定等影響，以及對(duì)術(shù)者技術(shù)要求較高，難免發(fā)生皮片部分或完全壞死的并發(fā)癥，因此，提高移植皮片的成活率具有重要的臨床意義。已有研究結(jié)果顯示，脂肪干細(xì)胞(ADSCs)干預(yù)可以促進(jìn)缺血組織內(nèi)新血管的生成，從而提高其成活率；局部應(yīng)用ADSCs可以提高皮瓣的成活能力[1-2]，但對(duì)于ADSCs能否提高移植皮片成活能力尚不明確。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)人ADSCs直接分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞及其影響血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)表達(dá)的能力，探討人ADSCs對(duì)大鼠帶真皮下血管網(wǎng)皮片移植成活的影響，為臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

原代ADSCs取自山東省人類臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞庫(kù)，于我院中心實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞室傳代培養(yǎng)。6～8周齡SPF級(jí)Wistar雄性大鼠20只，體質(zhì)量250～300 g，購(gòu)自山東魯抗公司，實(shí)驗(yàn)期間飼養(yǎng)于SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1ADSCs培養(yǎng)及鑒定 將細(xì)胞培養(yǎng)于含體積分?jǐn)?shù)0.10胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)液中，置于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2培養(yǎng)箱中，每2～3 d或待培養(yǎng)液顏色偏黃時(shí)進(jìn)行換液。當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)90%左右時(shí)，用2.5 g/L胰蛋白酶消化分離貼壁細(xì)胞，按照1∶2比例傳代。每日于光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及生長(zhǎng)情況。取生長(zhǎng)融合至90%的P3代ADSCs，用2.5 g/L胰酶消化離心，PBS清洗2次，調(diào)整細(xì)胞密度為1.5×109/L。取200 μL細(xì)胞懸液置于1.5 mL的EP管中，樣品管中加入CD34、CD44、CD45、CD73、CD90、CD105流式抗體，對(duì)照管中加入同型IgG陰性對(duì)照，4 ℃避光孵育30 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.25-乙炔基-2’脫氧尿嘧啶核苷(EdU)標(biāo)記ADSCs 將P4代ADSCs以1∶2比例傳代，2 d后換10 μmol/L 的EdU培養(yǎng)液孵育24 h。細(xì)胞融合達(dá)90%時(shí)進(jìn)行消化收集P5代細(xì)胞，PBS洗滌細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至1×109/L。在96孔板上同樣方法培養(yǎng)EdU標(biāo)記的樣本干細(xì)胞，參照EdU試劑盒說(shuō)明處理樣本細(xì)胞，倒置熒光顯微鏡下觀察ADSCs的EdU標(biāo)記情況。

1.2.3大鼠背部全層皮片移植模型建立 Wistar大鼠20只，隨機(jī)分為兩組，各10只。水合氯醛腹腔注射麻醉，背部除毛，參照Z(yǔ)OGRAFOU等[3]方法于大鼠背部中線設(shè)計(jì)3 cm×3 cm術(shù)區(qū)，切取帶真皮下血管網(wǎng)皮片，實(shí)驗(yàn)組皮片筋膜層注射密度1×109/L EdU標(biāo)記ADSCs懸液0.5 mL，注射點(diǎn)平均分為10點(diǎn)，每點(diǎn)0.05 mL；對(duì)照組同樣方法注射0.5 mL PBS。皮片原位植回術(shù)區(qū)，連續(xù)鎖邊縫合，使用抗生素與碘附浸濕的紗布打包固定。所有手術(shù)由同一術(shù)者相同方法實(shí)施，保證移植皮片均勻適當(dāng)受壓。術(shù)后大鼠單籠飼養(yǎng)，預(yù)防性應(yīng)用抗生素3 d。

1.2.4移植皮片成活率及組織學(xué)觀察 術(shù)后7 d，過(guò)量水合氯醛腹腔注射處死大鼠，根據(jù)外觀、質(zhì)地、顏色及針刺出血情況判斷移植皮片成活情況。植皮區(qū)拍照，應(yīng)用Image Pro Plus軟件分析皮片成活面積，根據(jù)公式：皮片成活率=(皮片成活面積/皮片設(shè)計(jì)面積)×100%，計(jì)算皮片的成活率。將移植皮片取下，多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)5 μm縱向切片，蘇木精-伊紅(HE)染色，光鏡下觀察皮片組織中壞死、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及新生血管形成情況。免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)皮片組織中血管內(nèi)皮系細(xì)胞特異性標(biāo)志物CD31及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)的表達(dá)：隨機(jī)選取40個(gè)高倍視野(200倍)，采用雙盲法測(cè)定每個(gè)視野內(nèi)的血管數(shù)量，計(jì)算微血管密度；每例標(biāo)本選取10個(gè)視野(200倍)，Image Pro Plus軟件分析VEGF表達(dá)。

1.2.5ADSCs在移植皮片內(nèi)分布及分化檢測(cè) 取未染色連續(xù)切片，參照EdU試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)組織EdU陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)，倒置熒光顯微鏡觀察ADSCs在組織中的分布情況，綜合HE染色與CD31免疫組化染色結(jié)果分析ADSCs在組織中的分化。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 ADSCs的體外培養(yǎng)形態(tài)學(xué)及表面標(biāo)志物鑒定

ADSCs細(xì)胞體外貼壁生長(zhǎng)，單核，形態(tài)呈成纖維細(xì)胞樣、長(zhǎng)梭形、旋渦狀整齊排列，傳代培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)穩(wěn)定。流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示，ADSCs表面標(biāo)志物CD44、CD73、CD90、CD105表達(dá)陽(yáng)性，造血細(xì)胞系標(biāo)記物CD34、CD45表達(dá)陰性。

2.2 EdU標(biāo)記干細(xì)胞檢測(cè)

倒置熒光顯微鏡下觀察，視野內(nèi)ADSCs全部核染，呈紅色熒光，細(xì)胞質(zhì)未染熒光，細(xì)胞呈梭形，EdU成功標(biāo)記于ADSCs。

2.3 移植皮片大體觀察及成活率

術(shù)后7 d,移植皮片的成活區(qū)域與壞死區(qū)域界限清晰，成活的皮片呈現(xiàn)粉白色、柔軟、紋理正常；壞死的皮片呈黑色或褐色，針刺不出血，去除表層痂皮后見(jiàn)化膿灶。實(shí)驗(yàn)組大鼠移植皮片成活率為(95.51±5.79)%，對(duì)照組為(70.04±10.79)%，兩組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.575，P<0.05)。

2.4 HE染色

HE染色光鏡下觀察，實(shí)驗(yàn)組皮片成活區(qū)可見(jiàn)大量新生血管，主要集中在真皮下層，尤其是新生肉膜區(qū)，炎癥浸潤(rùn)區(qū)域?。粚?duì)照組皮片成活區(qū)新生毛細(xì)血管數(shù)量較少，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)真皮層及肌層。

2.5 免疫組織化學(xué)染色

實(shí)驗(yàn)組大鼠移植皮片組織單位面積(每200倍視野)內(nèi)微血管數(shù)目為(10.55±4.43)個(gè)，對(duì)照組為(5.85±3.13)個(gè)，兩組比較差異有顯著性(t=3.870，P<0.05)。VEGF免疫組化陽(yáng)性表達(dá)為棕色，實(shí)驗(yàn)組VEGF廣泛表達(dá)，為新生的毛細(xì)血管；對(duì)照組表達(dá)不明顯。實(shí)驗(yàn)組VEGF的表達(dá)水平為130.31±8.71，對(duì)照組為54.22±13.82，兩組比較差異有顯著性(t=14.729，P<0.05)。

2.6 EdU標(biāo)記ADSCs熒光檢測(cè)

倒置熒光顯微鏡下觀察，EdU陽(yáng)性表達(dá)呈紅色高亮狀態(tài)，EdU陽(yáng)性細(xì)胞構(gòu)成血管樣結(jié)構(gòu)；經(jīng)對(duì)照CD31免疫組織化學(xué)染色結(jié)果，證實(shí)EdU陽(yáng)性細(xì)胞構(gòu)成新生血管內(nèi)皮，EdU標(biāo)記的ADSCs在受體內(nèi)直接分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞，參與構(gòu)建毛細(xì)血管。

3 討 論

皮片移植是整形和重建手術(shù)中頻繁使用的重要方法,如創(chuàng)面覆蓋、先天性缺陷整復(fù)、慢性創(chuàng)面修復(fù)等。因皮片成活受多種因素影響，其成活率在臨床手術(shù)中約為70%～100%。移植皮片發(fā)生部分或完全壞死難以避免，這給醫(yī)患雙方帶來(lái)無(wú)法彌補(bǔ)的痛苦，因此，提高移植皮片的成活率具有重要的臨床意義。移植皮片的成活關(guān)鍵在于與受皮區(qū)基底形成良好的血供，而新血管形成是構(gòu)建移植皮片與受皮區(qū)基底血供的關(guān)鍵。

自從ZUK等[4]成功分離ADSCs后，ADSCs以其具有多向分化潛能、來(lái)源充足、易于體外分離培養(yǎng)、抗原性低等優(yōu)點(diǎn)越來(lái)越受到人們的關(guān)注。對(duì)于ADSCs的鑒定，目前沒(méi)有專一特異性的表面標(biāo)記物，所以需要進(jìn)行多項(xiàng)表型測(cè)定來(lái)確定。ADSCs源于中胚層，與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)表面標(biāo)志物有90%是一致的，CD73、CD29、CD44、CD105等表達(dá)陽(yáng)性，CD34、CD44、CD45、HLA2DR等表達(dá)陰性。本文鑒定結(jié)果與近年對(duì)干細(xì)胞的研究相符[5-8]。已有研究表明，ADSCs可以通過(guò)擴(kuò)展原有的毛細(xì)血管網(wǎng)及分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞形成新生血管[1-2,9]，同時(shí)有研究稱ADSCs可以促進(jìn)組織生長(zhǎng)因子表達(dá)，從而促進(jìn)血管生成和創(chuàng)面愈合[10-14]。利用ADSCs的這兩個(gè)作用提高缺血組織成活能力成為一種新的治療手段。

本實(shí)驗(yàn)探討局部移植ADSCs能否促進(jìn)大鼠帶真皮下血管網(wǎng)皮片移植成活及其機(jī)制。對(duì)移植皮片成活情況觀察及組織學(xué)研究結(jié)果表明，局部移植人ADSCs可以明顯提高大鼠移植皮片的成活率及成活能力；術(shù)后7 d，實(shí)驗(yàn)組皮片成活面積、顏色、質(zhì)地等成活情況指標(biāo)明顯優(yōu)于對(duì)照組；將皮片組織取下，肉眼觀察實(shí)驗(yàn)組肉膜層內(nèi)細(xì)小血管明顯多于對(duì)照組，這在皮片組織HE染色觀察及CD31免疫組化染色結(jié)果對(duì)比中也得到了證實(shí)。提示較高的血管密度是提高皮片成活能力的關(guān)鍵。

EdU體外標(biāo)記ADSCs的檢測(cè)結(jié)果表明，EdU能成功標(biāo)記于ADSCs細(xì)胞核。由于EdU標(biāo)記于細(xì)胞核中，可以隨著ADSCs的增殖分化在組織內(nèi)持續(xù)表達(dá)，因此，檢測(cè)組織內(nèi)EdU陽(yáng)性表達(dá)可以準(zhǔn)確反映ADSCs在組織內(nèi)的分化與分布。本文研究結(jié)果顯示，ADSCs在移植皮片組織內(nèi)呈單層血管內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)，形成管腔樣結(jié)構(gòu)，與CD31免疫組化結(jié)果綜合分析，ADSCs可以在組織內(nèi)分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞。這表明至少一部分ADSCs直接參與構(gòu)建新生毛細(xì)血管，與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果一致[4，8]。

研究結(jié)果還表明，ADSCs可以促進(jìn)組織分泌血管生成因子,如VEGF。VEGF對(duì)微血管發(fā)生、血管生成均有直接的促進(jìn)作用[1]。本文免疫組化結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)組VEGF表達(dá)明顯高于對(duì)照組，說(shuō)明移植到皮片組織的ADSCs可以通過(guò)促進(jìn)皮片組織內(nèi)VEGF表達(dá)，進(jìn)一步促進(jìn)新血管的生成。

研究表明，傳代以后的人ADSCs表面組織相容性抗原表達(dá)減少，并且在與異體基因外周血單核細(xì)胞共同培養(yǎng)時(shí)不會(huì)引起T細(xì)胞的細(xì)胞毒作用[15]。本實(shí)驗(yàn)中，大鼠在實(shí)驗(yàn)期間沒(méi)有發(fā)生明顯的不良反應(yīng)，移植細(xì)胞成功在大鼠組織內(nèi)分化，說(shuō)明傳代后人ADSCs具有低免疫原性。

綜上所述,局部移植人ADSCs可以促進(jìn)大鼠帶真皮下血管網(wǎng)皮片移植的成活，該作用是通過(guò)促進(jìn)組織分泌VEGF及ADSCs在組織內(nèi)參與構(gòu)建新生血管實(shí)現(xiàn)的。深入研究ADSCs對(duì)皮片移植成活促進(jìn)作用的具體機(jī)制及準(zhǔn)確的應(yīng)用方法，會(huì)對(duì)自體皮片移植及異體皮片移植產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響，為臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)及方法。

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