體外誘導(dǎo)干細(xì)胞向多巴胺神經(jīng)元分化的研究進(jìn)展

李 恒，王宏心，朱天瑞，李曉紅

(山東大學(xué)附屬濟(jì)南市中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，山東濟(jì)南250013)

多巴胺(dopamine，DA)神經(jīng)元是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的一種重要神經(jīng)元，控制軀體的姿勢(shì)和肢體自主運(yùn)動(dòng)，調(diào)節(jié)機(jī)體的精神、情緒活動(dòng)DA 神經(jīng)元主要分布于中腦黑質(zhì)的致密部(SNc)、腹側(cè)被蓋區(qū)(VTA)、紅核后區(qū)(RRF)，其變性和缺失可以導(dǎo)致帕金森病的發(fā)生。目前的藥物、手術(shù)僅限于控制癥狀，不能糾正DA 神經(jīng)元的變性、缺失。具有向DA 神經(jīng)元分化潛能的干細(xì)胞，可以通過(guò)移植替代變性缺失的DA 神經(jīng)元達(dá)到治療疾病的目的。自20世紀(jì)80年代開(kāi)展的胎腦干細(xì)胞移植治療帕金森病的臨床試驗(yàn)，證實(shí)了這一技術(shù)的可行性和有效性［1－2］。進(jìn)而，通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)探討不同來(lái)源干細(xì)胞向DA 神經(jīng)元的分化潛能以及提高分化效率的誘導(dǎo)方法，成為目前干細(xì)胞研究的一大熱點(diǎn)。本文將對(duì)目前體外實(shí)驗(yàn)研究中所采用的方法進(jìn)行綜述和比較，探討不同來(lái)源干細(xì)胞向DA 神經(jīng)元分化的潛能和有效誘導(dǎo)途徑。

1 細(xì)胞因子

1.1 細(xì)胞誘導(dǎo)因子

根據(jù)胚胎干細(xì)胞向DA神經(jīng)元分化過(guò)程中的基因調(diào)控特點(diǎn)，采用幾種重要細(xì)胞因子調(diào)控特異性基因表達(dá)，可以促進(jìn)干細(xì)胞向DA 神經(jīng)元分化。常用的細(xì)胞誘導(dǎo)因子主要有音猬因子(sonic hedgehog，SHH)、成纖維生長(zhǎng)因子(fibroblast growth factor，F(xiàn)GF8)、無(wú)翅畸形整合小鼠乳腺腫瘤同源基因位點(diǎn)1 因子(wingless-type MMTV integration site family member1，Wnt1)。在胚胎的發(fā)育過(guò)程中，F(xiàn)GF8 在菱腦峽(中腦和后腦的交界區(qū))表達(dá)，SHH 在室管膜區(qū)(ventricular，VZ)表達(dá)，兩者的相互作用決定中腦DA 神經(jīng)元的產(chǎn)生［3］。因此，通過(guò)采用上述細(xì)胞因子聯(lián)合誘導(dǎo)的方法，在多種來(lái)源干細(xì)胞體外向DA神經(jīng)元誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)中取得了成功。

SHH、FGF8 聯(lián)合誘導(dǎo)可以促進(jìn)堿性成纖維生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)擴(kuò)增的第2 代人胚胎神經(jīng)干細(xì)胞向DA 神經(jīng)元分化，達(dá)到大約66%的分化效率(總分化率)，通過(guò)立體定向法將分化細(xì)胞移植至帕金森大鼠模型的中腦黑質(zhì)區(qū)，促進(jìn)了動(dòng)物模型疾病的恢復(fù)，但移植后的細(xì)胞僅有少部分表達(dá)DA 轉(zhuǎn)運(yùn)體，說(shuō)明移植的細(xì)胞并沒(méi)有完全分化為成熟DA 神經(jīng)元［4］。

SHH 和FGF8 同樣可以誘導(dǎo)成體間充質(zhì)干細(xì)胞高效地分化為DA 神經(jīng)元，通過(guò)采用bFGF 擴(kuò)增并序貫加入SHH、FGF8 的方法，在Neurobasal + B27 的紋狀體神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)基中誘導(dǎo)，可以促進(jìn)大約67%的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為DA 神經(jīng)元，進(jìn)一步加入膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子(glial cell line-derived neurotrophic factor，GDNF)培養(yǎng)，可以促進(jìn)成熟DA 神經(jīng)元的鈉、鈣離子通道表達(dá)［5］。國(guó)內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)采用bFGF、表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor，EGF)、SHH、FGF8 等序貫誘導(dǎo)的方法也可以促進(jìn)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分化為DA 神經(jīng)元，不同于上述骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)方法的是誘導(dǎo)時(shí)間和SHH 的劑量相對(duì)較少，使用的N2 神經(jīng)培養(yǎng)基未加入B27 添加劑(含維甲酸等促神經(jīng)分化的成分)，因而DA 神經(jīng)元的分化效率相對(duì)較低［6］。

1.2 神經(jīng)生長(zhǎng)因子

GDNF 和腦源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)主要促進(jìn)DA 神經(jīng)元的存活和成熟，在體外干細(xì)胞誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)中多與其他誘導(dǎo)劑聯(lián)合使用［5，7－10］，也有體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)GDNF 同白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor，LIF)聯(lián)合應(yīng)用可以促進(jìn)胚胎神經(jīng)干細(xì)胞分化為具有DA 遞質(zhì)釋放能力的成熟DA 神經(jīng)元，其中GDNF 在分化中發(fā)揮了關(guān)鍵的誘導(dǎo)作用［11］。

2 化學(xué)誘導(dǎo)劑

2.1 糖原合成酶-3β 抑制劑

CHIR99021 是一種糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β)的選擇性抑制劑，通過(guò)激活Wnt 信號(hào)通路［12］，促進(jìn)DA 神經(jīng)元分化重要調(diào)控因子-同源框轉(zhuǎn)錄因子LMX1A(LIM homeobox transcription factor-1a)以及FOXA2 的表達(dá)，同SHH和FGF8 聯(lián)合作用可以明顯提高胚胎干細(xì)胞向成熟DA 神經(jīng)元的分化效率，通過(guò)細(xì)胞移植治療促進(jìn)了小鼠、大鼠、恒河猴3 種帕金森動(dòng)物模型疾病的恢復(fù)［13］。另外，國(guó)內(nèi)的研究證實(shí)CHIR99021 協(xié)同SHH、FGF8 也可以促進(jìn)人和猴來(lái)源的ips 細(xì)胞分化為成熟的DA 神經(jīng)元［14］。

2.2 腺苷酸環(huán)化酶激活劑

腺甘酸環(huán)化酶激活劑forskolin 可以提高細(xì)胞內(nèi)環(huán)磷酸腺苷cAMP 的水平，通過(guò)激活上游轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件(cAMP response elements，CREs)促進(jìn)DA 神經(jīng)元特異性酪氨酸羥化酶基因的表達(dá)［15］。同GDNF、SHH、FGF8 聯(lián)合應(yīng)用可以促進(jìn)大約10%的人牙髓神經(jīng)干細(xì)胞分化為具有遞質(zhì)釋放能力的DA 神經(jīng)元［9］。近期的國(guó)內(nèi)研究結(jié)果證明，采用SHH、FGF8聯(lián)合，然后序貫加入福斯克林、GDNF 和壞血酸的聯(lián)合誘導(dǎo)方法也可以促進(jìn)成年大鼠骨骼肌來(lái)源的干細(xì)胞分化為DA 神經(jīng)元［10］。

3 基質(zhì)細(xì)胞或神經(jīng)基質(zhì)共培養(yǎng)

采用同基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)的方法，可以促進(jìn)干細(xì)胞向DA 神經(jīng)元分化。常用的共培養(yǎng)細(xì)胞主要為胚胎基質(zhì)細(xì)胞，如PA6 細(xì)胞系。有研究表明，PA6基質(zhì)細(xì)胞分泌的SHH 細(xì)胞誘導(dǎo)因子，在DA 神經(jīng)元的分化中發(fā)揮關(guān)鍵作用［16］;含有人胎腦基質(zhì)(過(guò)濾細(xì)胞的中腦組織濾液)的培養(yǎng)基聯(lián)合低氧刺激環(huán)境，同樣可以促進(jìn)人胚胎干細(xì)胞向DA 神經(jīng)元分化［17］。

4 基因轉(zhuǎn)染

目前研究證實(shí):胚胎干細(xì)胞向DA 神經(jīng)元的分化受多種調(diào)控因子影響，在分化的早期受維甲酸(retinoic acid，RA)、Wnt1/5a、SHH、TGF-β、FGF-8、Lmx1a/b 信號(hào)激活的影響，中期的分化受神經(jīng)發(fā)生素(neurogenin2，Ngn2)、Mash1(mammalian achaeteschute homologue-1)、NK6 轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)1(NK6 transcription factor related locus 1，Nkx6.1)、Sox2(sex determining region Y-box2)調(diào)控信號(hào)的影響，分化后期主要受Nurr1、En1/2 信號(hào)的激活和Ngn2 信號(hào)的下調(diào)影響［3］。

體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)通過(guò)轉(zhuǎn)染促神經(jīng)元分化的bHLH(basic helix-loop-helix)家族的Mash1 基因，可以協(xié)同Nurr1 促進(jìn)胚胎干細(xì)胞向具有DA 遞質(zhì)釋放功能的成熟神經(jīng)元分化，而轉(zhuǎn)染Ngn1/2、NeuroD 則產(chǎn)生抑制分化的作用［18］。一般認(rèn)為單純轉(zhuǎn)染Nurr1并不能夠誘導(dǎo)成熟DA 神經(jīng)元形成，但近期的實(shí)驗(yàn)證實(shí)通過(guò)調(diào)控基因轉(zhuǎn)染的條件(去掉bFGF 擴(kuò)增條件的第7 天，通過(guò)強(qiáng)力霉素適當(dāng)下調(diào)Nurr1 的表達(dá))也可以誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞向成熟DA 神經(jīng)元分化，但所獲得的DA 神經(jīng)元數(shù)量有所下降［19］。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)Foxa2 不僅可以協(xié)同Nurr1 基因促進(jìn)胚胎干細(xì)胞分化為成熟DA 神經(jīng)元，還可以增加分化細(xì)胞對(duì)MPTP (1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶)和H2O2氧化應(yīng)激的毒性耐受能力，進(jìn)一步通過(guò)細(xì)胞移植至帕金森大鼠模型的紋狀體區(qū)域沒(méi)有發(fā)現(xiàn)異常腫瘤出現(xiàn)，并促進(jìn)了大鼠行為學(xué)的改善［20］。

總之，大量體外實(shí)驗(yàn)證明不同來(lái)源的具有多向分化潛能的干細(xì)胞均具有向DA 神經(jīng)元的分化潛能，在不同誘導(dǎo)刺激條件下表現(xiàn)出不同的分化效率。通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)研究，選擇一種更為高效、安全的誘導(dǎo)方法，提供一種來(lái)源廣泛、成熟的、具有DA 神經(jīng)遞質(zhì)釋放能力的種子細(xì)胞來(lái)源，可以促進(jìn)干細(xì)胞移植治療在帕金森氏病的應(yīng)用和推廣。

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