沙門氏菌快速檢測技術(shù)研究進(jìn)展

章偉帆

（泉州市產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)所，福建 泉州 362000）

沙門氏菌是一類革蘭氏陰性菌，其廣泛分布于自然界，是常見的人畜共患型致病菌。沙門氏菌對外界的抵抗力較強(qiáng)，耐膽鹽，對營養(yǎng)需求不高。目前，已知沙門氏菌就將近2213種，而且?guī)缀跛械纳抽T氏菌都能引起嚴(yán)重的食物中毒事件，是導(dǎo)致食物中毒的主要病原菌，對人類健康安全造成重大威脅。在美國，每年有650萬～3300萬人發(fā)生食物中毒，近5000人因此而喪生［1］。為此，美國政府每年需要花費(fèi)近50億～60億美元［2］。在中國，沙門氏菌同樣嚴(yán)重危害著我國的食品安全。據(jù)相關(guān)數(shù)據(jù)表明，我國每年因沙門氏菌而導(dǎo)致的食物中毒事件占所有食物中毒事件的40%～60%。所以，建立一種快速有效的檢測手段是減少食物中毒事件的重要手段。但是由于沙門氏菌的血清型過于繁多，傳統(tǒng)的檢測方法又需要經(jīng)過預(yù)增菌、選擇性曾菌、分離培養(yǎng)、生化鑒定及血清學(xué)分型鑒定5個步驟。繁雜的生化反應(yīng)使得檢測過程十分復(fù)雜，耗時耗力，至少需要4～7天才能得到精確的檢測結(jié)果。因此，尋找一種快速、有效、準(zhǔn)確、簡便的檢測技術(shù)成為國內(nèi)外學(xué)者研究的方向。下面就近年來對于沙門氏菌新的檢測技術(shù)做一個簡單的介紹。

1 免疫學(xué)檢測方法

在所有檢測食品中的沙門氏菌的技術(shù)手段中，免疫學(xué)檢測技術(shù)占有重要的地位，主要是因?yàn)槠鋬r格低廉，不需要特定的實(shí)驗(yàn)儀器，容易在基層推廣開來。其基本原理就是利用抗原抗體之間的特異性結(jié)合而到達(dá)檢測目的。

1.1 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) （ELISA）

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) （ELISA）的基本原理是將抗原或者抗體先固定在某種固相載體上，然后加入酶標(biāo)抗原或者抗體和受檢樣品，與固相載體上的抗原或者抗體發(fā)生特異性結(jié)合，從而形成抗原抗體復(fù)合物。將固相載體上多余的反應(yīng)液清除后，加入酶反應(yīng)底物，使得反應(yīng)底物被固相載體上的酶所催化，產(chǎn)生有色物質(zhì)，最后通過測量有色物質(zhì)的含量來分析樣品中待測物質(zhì)的含量［3］。

1977年，Krysinski和Heimsch利用沙門氏菌鞭毛抗體，首次將ELISA方法應(yīng)用于食品檢測［4］。最初ELISA方法雖然能在48h內(nèi)快速檢測出沙門氏菌，但是由于所使用的多價抗血清在不同程度上存在交叉反應(yīng)，使得最初用ELISA檢測方法所得到的檢測結(jié)果假陽性很高，而且靈敏度為105cfu/mL。隨著單克隆抗體技術(shù)的產(chǎn)生，Robinson等［5］建立了直接ELISA檢測方法，該檢測方法大大降低了因交叉反應(yīng)而出現(xiàn)的假陽性現(xiàn)象，顯示出單抗的卓越性能。在我國，焦新安等［6］利用單抗技術(shù)獲取了具有沙門氏菌廣譜結(jié)合特性的4種單克隆抗體，其中2種反應(yīng)互補(bǔ)，對已檢沙門氏菌的覆蓋率高達(dá)99%，而且并沒有與受檢大腸桿菌發(fā)生交叉反應(yīng)；黎兆滾等［7］利用ELISA技術(shù)檢測94份魚粉樣品中的沙門氏菌，所得的結(jié)果中陰性符合率為100%，陽性符合率為92%，總符合率為98%；另外，文其乙等［8］利用沙門氏菌特異性單抗de7和CB8形成了快速檢測試劑盒，對500份蛋品進(jìn)行ELISA檢測，檢測結(jié)果可靠，陽性率比國際標(biāo)準(zhǔn)方法高。

1.2 免疫磁珠分離技術(shù) （IMS）

免疫磁珠分離技術(shù)法 （IMS）技術(shù)的原理是將特異性抗體偶聯(lián)在磁性顆粒表面，在外加磁場的作用下與受檢樣品中的靶細(xì)胞特異性結(jié)合，使得靶細(xì)胞能夠富集、分離。近年來，研究人員利用免疫磁珠來富集沙門氏菌，從而使得檢測更加快捷。1996年，Mansfield和Forsythe比較了選擇性培養(yǎng)基富集法和免疫磁珠捕捉法富集對120種食物進(jìn)行沙門氏菌的富集和分離。結(jié)果表明免疫磁珠捕捉法富集效果和選擇性培養(yǎng)基富集的效果相同［9］。IMS檢測技術(shù)雖然在特異性方面具有很大的優(yōu)勢，但是靈敏度不足，所以近年來IMS技術(shù)都是與ELISA、PCR、Taqman PCR技術(shù)相結(jié)合，形成IMSELISA、IMS－PCR、IMS－TaqmanPCR技術(shù)，這樣就大幅度的增加了檢測的靈敏度，提高檢測的準(zhǔn)確率。

Kofitsyo等［10］利用免疫磁珠富集分離技術(shù)與酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)相結(jié)合，即IMS－ELISA技術(shù)檢測食品中的沙門氏菌，包括前期的樣品處理，整個檢測過程只花費(fèi)了26h，檢測最低限為105cfu/mL；2008年Virve等利用免疫磁珠富集分離技術(shù)與熒光定量PCR相結(jié)合，即IMS－Taqman PCR技術(shù)，對食品中的沙門氏菌進(jìn)行檢測，包括樣品處理的6h，整個流程只需要8h，而且靈敏度、準(zhǔn)確度、特異性分別為98.4%、99.1%、100.0%［11］；2009年，Mercanoglu等［12］利用免疫磁珠富集分離技術(shù)與PCR技術(shù)有效的結(jié)合，建立快速有效檢測沙門氏菌的IMS－PCR方法，對牛奶中的沙門氏菌進(jìn)行檢測只需要14h，而且檢測的靈敏度達(dá)到1～10cfu/mL。

2 分子生物學(xué)技術(shù)檢測

分子生物學(xué)檢測方法是近年來發(fā)展最為迅速的食品檢測手段之一，由于其具有簡便快捷，特異性強(qiáng)，準(zhǔn)確性高等優(yōu)點(diǎn)，使得它在食品安全檢測上表現(xiàn)出很大的優(yōu)越性。

2.1 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù) （PCR技術(shù)）

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù) （PCR）是近年來發(fā)展較快的一項(xiàng)檢測技術(shù)，它具有簡便，快捷，特異性強(qiáng)以及靈敏度高等特點(diǎn)，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于食品安全檢測。PCR技術(shù)檢測沙門氏菌的基本原理很簡單，就是通過設(shè)計(jì)特異性引物，擴(kuò)增沙門氏菌中保守性高的核酸序列，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析受檢樣品中是否含有沙門氏菌，所以PCR技術(shù)的關(guān)鍵在于靶序列的選擇和引物的設(shè)計(jì)。

近年來對于PCR檢測技術(shù)的報(bào)道很多。invA基因是決定沙門氏菌的侵染力的，所編碼的蛋白普遍存在于沙門氏菌表面，其序列具有高度的保守性［13］。Rahn等［14］利用沙門氏菌的invA基因作為靶序列，對630種沙門氏菌和142種非沙門氏菌進(jìn)行檢測，結(jié)果表明在非沙門氏菌中沒有一個菌種擴(kuò)增出目的條帶，在630種沙門氏菌中除了4個菌種外，其余菌種均擴(kuò)增出目的條帶；在歐洲，由4個歐洲實(shí)驗(yàn)室聯(lián)合對435個天然樣品進(jìn)行檢測，結(jié)果表明用invA基因作為靶序列進(jìn)行檢測的特異性和準(zhǔn)確性高達(dá)97.5%［15］。

在國內(nèi)，我國研究人員也報(bào)道了許多有關(guān)該技術(shù)的文章。黃金林等［16］開發(fā)設(shè)計(jì)了沙門氏菌中高度保守的組氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)操縱子基因序列的引物，并對15株沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株，10株非沙門氏菌菌株以及27株現(xiàn)場分離的沙門氏菌菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果表明所有對照菌株均未出現(xiàn)目的條帶，而沙門氏菌菌株皆有495bp的目的條帶，從結(jié)果可以說明所開發(fā)的這對引物對沙門氏菌的檢測表現(xiàn)出極高的特異性；孔繁德等［17］根據(jù)沙門氏菌基因組序列中高度保守的序列fimY基因，建立了用于檢測沙門氏菌的PCR通用方法，并用該方法對廈門地區(qū)的禽類產(chǎn)品進(jìn)行了沙門氏菌的檢測，取得了喜人的成績；汪琦等［18］利用PCR方法快速檢測方法對全脂奶粉、生牛肉和加工過的雞肉中的沙門氏菌進(jìn)行檢測，其檢測結(jié)果與傳統(tǒng)檢測手段檢測結(jié)果一致，檢出限為100cfu/25g，準(zhǔn)確性達(dá)100%。

2.2 熒光定量PCR

熒光定量PCR不同于常規(guī)PCR之處在于，它能夠?qū)NA進(jìn)行定量檢測，而且敏感性達(dá)到4.5 cuf/mL，是常規(guī)PCR的100倍，特異性高，能夠避免PCR污染問題。其原理是在PCR過程中加入一個含有熒光基團(tuán)標(biāo)記的特異性寡核苷酸鏈探針，該探針兩端分別標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)和熒光報(bào)告基團(tuán)。在PCR過程中，熒光淬滅基團(tuán)從探針上脫落，從而使得熒光報(bào)告基團(tuán)發(fā)出的熒光能夠被熒光系統(tǒng)檢測到。根據(jù)檢測到的熒光信號對PCR過程進(jìn)行實(shí)時監(jiān)測，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對樣品進(jìn)行定量分析檢測。

Seo等［19］在對雞蛋的檢測中，采用熒光定量PCR手段對D型沙門氏菌特有的sefA基因進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果表明使用熒光定量PCR手段與常規(guī)檢測方法檢測的結(jié)果一致，而且最低檢出限僅為1cfu/600g雞蛋清洗液；Malorny等［20］在對雞蛋和禽肉樣品的沖洗液進(jìn)行檢測中，用Taqman探針擴(kuò)增腸道沙門氏菌所特有的Prot6e基因，發(fā)現(xiàn)結(jié)果與常規(guī)檢測100%一致，且最低檢出限為3cfu/50mL；我國科研人員鐘偉軍［21］等根據(jù)stn基因設(shè)計(jì)了1對特異性引物和熒光探針，stn是能夠編碼鼠傷寒沙門氏菌腸毒素的基因，他們通過摸索熒光定量PCR體系和條件，建立了一套檢驗(yàn)沙門氏菌的熒光定量PCR方法。他們利用這套方法對人工污染沙門氏菌的雞蛋 （沙門氏菌初始含菌量為1cfu/g）和豬肉 （沙門氏菌初始含菌量為1cfu/g）進(jìn)行檢測，結(jié)果皆為陽性，具有較強(qiáng)的特異性和高的敏感性。

2.3 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增 （LAMP）

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)是由 Notomi等［22］在2000年開發(fā)的一種新的核酸擴(kuò)增技術(shù)。它的原理是根據(jù)靶序列上的6個特定區(qū)域設(shè)計(jì)4條引物，在65℃恒溫條件下，利用具有鏈置換活性的Bst DNA聚合酶能夠在1h內(nèi)擴(kuò)增出109個靶序列拷貝的核酸擴(kuò)增技術(shù)。在擴(kuò)增過程中，反應(yīng)液中的鎂離子能夠與從核苷酸中析出的焦磷酸根離子結(jié)合，生成肉眼可見的白色沉淀——焦磷酸鎂。LAMP與常規(guī)PCR相比，其無需繁雜的電泳和紫外觀察過程，也不需要昂貴的PCR儀器，所以便于基層應(yīng)用。

LAMP技術(shù)的關(guān)鍵在于關(guān)鍵區(qū)域的選擇和特異性引物的設(shè)計(jì)。研究發(fā)現(xiàn)invA基因在不同沙門氏菌菌株之間存在較高的同源性，而且通過Blast分析，該基因與其他物種并無同源關(guān)系，所以invA基因是沙門氏菌的一個重要的特殊區(qū)域。黃金海等［23］通過對invA基因進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，通過LAMP技術(shù)對4種非沙門氏菌和7種沙門氏菌血清型進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)7種沙門氏菌皆能進(jìn)行有效擴(kuò)增，而4種對照菌不能擴(kuò)增，這說明利用invA基因設(shè)計(jì)出的特異性引物對于檢測沙門氏菌具有極好的特異性。而且在對于食品中沙門氏菌的檢測中，樣品中最低檢限為336cfu/mL，具有很高的靈敏性。

LAMP具有特異性強(qiáng)，靈敏性高，操作簡便，無需儀器等優(yōu)點(diǎn)。重要的是運(yùn)用LAMP技術(shù)檢測沙門氏菌只需要2h，即使加上增菌時間，也只需15h，便于基層的推廣，具有很高的實(shí)用價值。

2.4 基因芯片 （DNA chip）

基因芯片又稱生物芯片、DNA芯片。其原理是將許多已知的DNA探針固定在玻片或者硅片上，微生物樣品DNA可以通過PCR的方法標(biāo)記探針。然后將經(jīng)過熒光標(biāo)記的樣品分子與固定在基因芯片上的DNA探針進(jìn)行雜交。用洗脫液將沒有雜交的樣品分子洗脫后，通過熒光信號的強(qiáng)弱來判斷樣品分子的序列信息和數(shù)量，最后利用序列信息來分析樣品中是否含有目的菌。該方法可以一次性檢測多種病原菌，而且具有特異性強(qiáng)，靈敏度高，快速準(zhǔn)確等特點(diǎn)，在檢測沙門氏菌等致病菌中具有廣泛的應(yīng)用前景。

Cremonesi等［24］利用細(xì)菌的16SrRNA基因設(shè)計(jì)探針，制成基因芯片，成功運(yùn)用于微生物中病原菌的檢測；2006年，為了確認(rèn)和驗(yàn)證鼠傷寒沙門氏菌的致病基因，Shannon等［25］利用基因芯片，通過PCR擴(kuò)增了10個目的基因，并制成熒光探針標(biāo)記與DNA雜交，這些基因包括：orgA、spi4H、purR、ORF319、rmbA、misL、spi4F、spi4N、rRNA以及ttrB，最終成功的檢測到了71個致病基因，這個結(jié)果表明通過PCR擴(kuò)增增加了基因芯片雜交的準(zhǔn)確度和可信度；Wilson等［26］利用病原體致病基因和20寡核苷酸藻紅素標(biāo)記探針，開發(fā)了一套可以精確識別18種真核生物、原核生物和致病性病毒的DNA微陣列。

3 檢測沙門氏菌的其他方法

除了上述所介紹的免疫學(xué)方法和分子生物學(xué)方法，近年來其他越來越多的新技術(shù)也體現(xiàn)出它的優(yōu)越性。

3.1 生物傳感器 （Biosensor）

生物傳感器的原理是將待測樣品與儀器中的生物分子識別原件發(fā)生反應(yīng)，然后通過儀器中特有的信號轉(zhuǎn)換器將反應(yīng)信號轉(zhuǎn)變成可辨別的光信號或者電信號。所以，影響生物傳感器檢測的特異性和靈敏性的關(guān)鍵在于儀器中的生物分子識別原件以及信號轉(zhuǎn)換器。Pathiran等［27］使用沙門氏菌的多克隆抗體制成生物分子識別原件，制成可用于檢測沙門氏菌的生物傳感器，該傳感器反應(yīng)時間小于100s，最低敏感度為102個細(xì)胞/mL。雖然生物傳感器具有自動化程度高，分析速度快，對使用者要求低等特點(diǎn)，但由于生物分子識別原件壽命短，生產(chǎn)成本高，這是阻礙該方法發(fā)展的重要原因。

3.2 熱裂解氣相色譜－質(zhì)譜技術(shù) （Py－GC－MS）

熱裂解氣相色譜—質(zhì)譜技術(shù)是一種簡單、快速、靈敏度高的一種新技術(shù)，目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用于微生物的鑒定和檢驗(yàn)當(dāng)中。郭愛玲等［28］采用Py－GC－MS技術(shù)對沙門氏菌細(xì)胞進(jìn)行檢測，通過分析總離子流色譜圖，確定沙門氏菌熱裂解氣相色譜－質(zhì)譜的條件與部分裂解產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)，從而能夠?yàn)榭焖勹b定沙門氏菌提供新的方法；董海燕［29］建立了一套Py－GC－MS快速檢測沙門氏菌的方法，她將4種沙門氏菌全細(xì)胞在650℃下裂解，時間為12s，離子源溫度230℃的條件下，得到了4張總離子色譜圖，確定了4種沙門氏菌裂解產(chǎn)物 （吲哚、苯酚、1－十三烯）的分子結(jié)構(gòu)，為快速檢測沙門氏菌奠定了基礎(chǔ)。

3.3 電阻抗法

近年來一項(xiàng)新的生物技術(shù)——電阻抗法已經(jīng)逐步應(yīng)用于食品中微生物的檢測，而且對食品中沙門氏菌的檢測已經(jīng)通過了AOAO的認(rèn)可。其原理是根據(jù)不同微生物在生長和繁殖過程中，將培養(yǎng)基內(nèi)電惰性大分子底物分解成電活性小分子產(chǎn)物的能力不同，從而導(dǎo)致電阻抗降低的程度不同。Pless等［30］用電阻抗法和傳統(tǒng)檢測方法對250種食品中進(jìn)行沙門氏菌檢測，結(jié)果表明在122種沙門氏菌污染食品中，電阻抗法檢出了119種，而傳統(tǒng)檢測方法僅檢出了106種；陳廣全等［31］對21種人工加入沙門氏菌的食品進(jìn)行檢測，分別用了電阻抗法和傳統(tǒng)檢測方法，結(jié)果電阻抗法檢測結(jié)果與傳統(tǒng)檢測結(jié)果一致，對于陰性結(jié)果可以在48h內(nèi)得到。這說明電阻抗法能夠快速、準(zhǔn)確地檢測出食品中的沙門氏菌。

4 小結(jié)

隨著生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，新的食品檢測技術(shù)層出不窮。這些技術(shù)與傳統(tǒng)檢測方法相比較而言，具有快速、簡便、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)。分子生物學(xué)檢測手段雖然能夠快捷地檢測沙門氏菌，但是技術(shù)難度大，成本高，推廣難度大。而免疫學(xué)方法中ELISA應(yīng)用較為普遍，隨著相關(guān)研究的不斷深入，ELISA技術(shù)在食品檢測中發(fā)揮著越來越重要的作用?？傊?，隨著免疫學(xué)和分子生物學(xué)的發(fā)展，相信對于食品中沙門氏菌的檢測技術(shù)將向著快捷、特異性強(qiáng)、靈敏度高、經(jīng)濟(jì)實(shí)惠的方法不斷發(fā)展。

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