短乳桿菌發(fā)酵生產(chǎn)尿苷磷酸化酶條件的優(yōu)化

王偉潔，李紅梅,*，鄧龍華，高露姣，黃艷青

(1.上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海 200093；2.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所，上海 200090)

尿苷磷酸化酶是嘧啶補(bǔ)救途徑中的關(guān)鍵酶，具有可逆性催化尿苷轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏さ漠惢土姿峄饔?，廣泛存在于生物有機(jī)體中。尿苷磷酸化酶在酶法合成抗腫瘤核苷類藥物中具有重要作用[1]，其中脫氧氟尿苷DFUR是一種良好的抗代謝類抗腫瘤藥物，在腫瘤細(xì)胞內(nèi)受腫瘤組織中嘧啶磷酸化酶的作用而轉(zhuǎn)化為真正起作用的5-氟尿嘧啶；此外尿苷磷酸化酶在腫瘤診斷中具有一定醫(yī)學(xué)價(jià)值，腫瘤組織細(xì)胞中尿苷磷酸化酶的含量比正常細(xì)胞高很多，可以作為細(xì)胞癌變的檢測(cè)指標(biāo)[2]。

目前通過傳統(tǒng)篩選和誘變技術(shù)獲得了一些具有較高酶活力的菌種如產(chǎn)氣腸桿菌、乙酰短桿菌等應(yīng)用于核苷類似物的酶法合成[3]，但關(guān)于短乳桿菌產(chǎn)核苷磷酸化酶卻鮮有報(bào)道，野生型短乳桿菌仍存在產(chǎn)酶量相對(duì)較低等缺點(diǎn)，因此如何提高短乳桿菌產(chǎn)核苷磷酸化酶具有重要的研究和應(yīng)用價(jià)值。

現(xiàn)有篩選重要影響因子的方法中，以Plackett-Burman設(shè)計(jì)最具優(yōu)勢(shì)，它能快速有效地從眾多因子中篩選出影響短乳桿菌產(chǎn)尿苷磷酸化酶顯著的因子[4-5]。響應(yīng)面法能快速對(duì)影響顯著因子進(jìn)行優(yōu)化與評(píng)價(jià)，并確定各因素最佳組合和響應(yīng)值的最優(yōu)值[6]。目前響應(yīng)面分析方法已大量應(yīng)用于微生物工程領(lǐng)域的實(shí)驗(yàn)分析中[7-9]。因此，以短乳桿菌為出發(fā)菌，以葡萄糖酵母膏培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，利用Plackett-Burman設(shè)計(jì)、最陡爬坡試驗(yàn)及響應(yīng)面法對(duì)影響酶活的各因子水平及其交互作用進(jìn)行優(yōu)化與評(píng)價(jià)，并快速有效地確定多因子系統(tǒng)的最佳條件，旨在為高產(chǎn)尿苷磷酸化酶菌株的開發(fā)、應(yīng)用以及產(chǎn)酶發(fā)酵條件優(yōu)化等相關(guān)研究及后續(xù)研究提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 菌株

短乳桿菌 本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 試劑

胸苷、肌苷、尿苷、尿嘧啶等 河南新鄉(xiāng)拓新生化股份有限公司；其他化學(xué)試劑(均為分析純) 國(guó)藥集團(tuán)藥業(yè)公司。

1.3 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

1.3.1 培養(yǎng)基

菌種活化液(g/L)：酵母粉10.0，pH7.0～7.2；斜面培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖20.0、酵母粉10.0、氯化鈉5.0、瓊脂20.0，pH7.0～7.2；初始發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖20.0、酵母粉10.0、氯化鈉5.0，pH7.0～7.2；發(fā)酵培養(yǎng)基：根據(jù)不同實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)要求，改變培養(yǎng)基的各組分。

1.3.2 培養(yǎng)條件

將保存于深冷冰箱的短乳桿菌接種在固體斜面培養(yǎng)基上36℃培養(yǎng)24h，4℃冰箱中保存?zhèn)溆?。無(wú)菌環(huán)境下從斜面培養(yǎng)基上挑取單一菌落菌體接種到裝液量為50mL的250mL錐形瓶活化液中，在36℃搖床轉(zhuǎn)速為110r/min條件下活化10～12h，然后接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，同樣條件下繼續(xù)培養(yǎng)12h收集菌體。

1.4 酶活力測(cè)定

1.4.1 濕菌體的收集

將培養(yǎng)好的菌液4500r/min常溫離心15min，去除上清液后，用無(wú)菌水和pH7.3無(wú)菌磷酸鉀緩沖液各沖洗1次，離心去上清，收集濕菌體冷藏備用。

1.4.2 尿苷磷酸化酶活測(cè)定方法

據(jù)Saunders等[10]報(bào)道，采用紫外分光光度法測(cè)定反應(yīng)生成的尿嘧啶來(lái)表征產(chǎn)酶量。標(biāo)準(zhǔn)酶反應(yīng)混合液包含一定濃度的濕菌體50mg/mL反應(yīng)液，25mmol/L尿苷，1mmol/L EDTA，pH7.3、50mmol/L的磷酸鉀緩沖溶液。55℃條件下反應(yīng)120min，反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)液在沸水中煮沸5min終止反應(yīng)，離心去除沉淀[11]。上清液用pH12的NaOH稀釋100倍，以未添加菌體的反應(yīng)液作為對(duì)照測(cè)定不同培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件下反應(yīng)液在290nm波長(zhǎng)處的紫外光密度OD290nm的增值[12]。尿苷磷酸化酶酶活單位定義為：在上述條件下，1min內(nèi)OD290nm變化0.01所需的濕菌體量定義為短乳桿菌的1個(gè)酶活力單位[3]。

式中：K為稀釋倍數(shù)，取100；t為酶反應(yīng)時(shí)間(120min)；m為濕菌體質(zhì)量(50mg)。

1.5 發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

1.5.1 單因素試驗(yàn)

在基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中，分別添加適量的速效氮源蛋白胨、金屬離子Mg2+(MgCl2·6H2O)、磷酸根(K2HPO4·3H2O)、底物誘導(dǎo)劑(胸苷、肌苷及尿苷)，考察其對(duì)短乳桿菌產(chǎn)尿苷磷酸化酶的作用。

1.5.2 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)文獻(xiàn)查閱及前期單因素試驗(yàn)研究[13-14]，選取發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間、搖床轉(zhuǎn)速、接種量、葡萄糖、酵母粉、蛋白胨、磷酸根、尿苷和肌苷作為Plackett-Burman設(shè)計(jì)的10個(gè)因素，以尿苷磷酸化酶活作為響應(yīng)值，每個(gè)因素取兩個(gè)水平，高水平(＋1)約是低水平(－1)的1.5～2倍，另設(shè)3個(gè)虛擬列：X3、X6、X10以考察試驗(yàn)誤差。通過比較各因素的顯著水平，篩選出對(duì)酶活力影響較為顯著的因素。試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1。

表1 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案Table 1 Factors and levels used in Plackett-Burman design

1.5.3 最陡爬坡試驗(yàn)

根據(jù)Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果分析確定顯著影響因素，以擬合的回歸方程模型的系數(shù)符號(hào)和大小來(lái)設(shè)定顯著因素的步長(zhǎng)和變化方向，即對(duì)顯著因素進(jìn)行濃度梯度設(shè)計(jì)，使響應(yīng)值快速逼近最大響應(yīng)區(qū)間。

1.5.4 Box-Behnken設(shè)計(jì)

根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理[15-16]，以葡萄糖、磷酸根、尿苷、酵母粉4個(gè)因素為自變量，以尿苷磷酸化酶活為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)四因素三水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，并用Design-Export 8.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)篩選

利用底物誘導(dǎo)(胸苷、肌苷和底物尿苷)、添加金屬離子(MgCl2·6H2O)、速效氮源(蛋白胨)和磷酸鹽(K2HPO4·3H2O)等手段提高短乳桿菌產(chǎn)尿苷磷酸化酶能力[13]，結(jié)果如表2所示。可以看出，蛋白胨、磷酸根、肌苷和尿苷4個(gè)因素對(duì)短乳桿菌合成尿苷磷酸化酶有一定的促進(jìn)作用。蛋白胨為菌體生長(zhǎng)提供充足的氮源，提高菌體單位時(shí)間內(nèi)的豐度；磷酸根是尿苷磷酸化酶催化尿苷可逆磷酸化反應(yīng)的有效因子，可能會(huì)促進(jìn)菌體產(chǎn)尿苷磷酸化酶；而核苷、核苷酸及堿基對(duì)核苷磷酸化酶有一定的誘導(dǎo)作用，但不同微生物對(duì)誘導(dǎo)劑的響應(yīng)不同，E.coli中尿苷磷酸化酶可由胞苷誘導(dǎo)表達(dá)[14]，Salmonella typhimurium中尿苷磷酸化酶由尿苷和胞苷誘導(dǎo)[17]，本研究發(fā)現(xiàn)，尿苷和肌苷可誘導(dǎo)短乳桿菌產(chǎn)尿苷磷酸化酶。

表2 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果Table 2 Single factor design and corresponding results

2.2 Plackett-Burman設(shè)計(jì)及優(yōu)化

選用Factors=10，Runs=20的Plackett-Burman設(shè)計(jì)，見表3。根據(jù)表3結(jié)果采用Minitab15.0軟件進(jìn)行方差分析，結(jié)果(表4)表明，在發(fā)酵過程中，肌苷、發(fā)酵時(shí)間、酵母粉、磷酸根、蛋白胨及底物尿苷6個(gè)因素對(duì)短乳桿菌合成尿苷磷酸化酶呈正效應(yīng)關(guān)系，而搖床轉(zhuǎn)速、接種量、發(fā)酵溫度及葡萄糖添加量4個(gè)因素對(duì)短乳桿菌合成尿苷磷酸化酶呈負(fù)效應(yīng)關(guān)系。

表3 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Plackett-Burman design arrangement and corresponding results

表4 Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果的方差分析Table 4 Analysis of variance for the Plackett-Burman experimental design

在Plackett-Burman設(shè)計(jì)中，一般認(rèn)為P＜0.1的因素對(duì)系統(tǒng)的響應(yīng)值影響較為顯著，本研究中葡萄糖(P=0.002)、酵母粉(P=0.054)、磷酸根(P=0.059)和尿苷(P=0.001)對(duì)短乳桿菌合成尿苷磷酸化酶的影響較為顯著，因此將這4個(gè)因素作為主要因素進(jìn)行最陡爬坡試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)。其他因素正效應(yīng)取高水平，負(fù)效應(yīng)取低水平。其中葡萄糖和尿苷濃度對(duì)短乳桿菌產(chǎn)尿苷磷酸化酶影響非常顯著(P＜0.01)，葡萄糖添加量過低，導(dǎo)致營(yíng)養(yǎng)不足，添加量過高，可能會(huì)出現(xiàn)葡萄糖限制或其產(chǎn)物的抑制，均不利于尿苷磷酸化酶的產(chǎn)生[13]；尿苷可以促進(jìn)尿苷磷酸化酶活的試驗(yàn)結(jié)果可以初步判斷尿苷磷酸化酶為誘導(dǎo)酶，添加酶底物尿苷可以顯著提高短乳桿菌產(chǎn)酶量，這與Salmonella typhimurium[17]、Klebsiellasp.[18]產(chǎn)尿苷磷酸化酶可被尿苷誘導(dǎo)表達(dá)研究一致。

2.3 最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果

Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果顯示葡萄糖為負(fù)效應(yīng)，在后續(xù)設(shè)計(jì)中添加量應(yīng)減?。唤湍阜?、磷酸根添加量和尿苷濃度3個(gè)因素均為正效應(yīng)，在后續(xù)的設(shè)計(jì)中添加量應(yīng)增加。因此最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)應(yīng)根據(jù)各個(gè)因素效應(yīng)大小比例，來(lái)設(shè)定它們的變化步長(zhǎng)，如表5所示，短乳桿菌產(chǎn)尿苷磷酸化酶能力在第3組達(dá)到最大值(1.198U/mg)，因此，以第3組作為響應(yīng)面試驗(yàn)的中心點(diǎn)。

表5 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 5 Steepest ascent design and corresponding results

2.4 Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果及方差分析

Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表6，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果用Design Export 8.0響應(yīng)面分析軟件進(jìn)行多元回歸分析，結(jié)果見表7。經(jīng)擬合得到二次回歸數(shù)學(xué)模型，獲得短乳桿菌產(chǎn)尿苷磷酸化酶能力對(duì)葡萄糖、磷酸根、尿苷及酵母粉添加量的二次多項(xiàng)回歸方程為：

由該方程的方差分析可見，該模型極顯著(P＜0.0001)，失擬度在α=0.05水平上不顯著(P=0.0584＞0.05)，而且經(jīng)分析計(jì)算，該模型的確定系數(shù)R2=0.9183，表明模型與實(shí)際情況擬合很好，因此該模型可用于預(yù)測(cè)短乳桿菌產(chǎn)尿苷磷酸化酶能力的實(shí)際情況[19]。由回歸方程得到優(yōu)化結(jié)果為葡萄糖18.30g/L、磷酸根3.99g/L、尿苷21.38mmol/L、酵母粉15.71g/L，預(yù)測(cè)響應(yīng)面最大值為1.30887U/mg。

利用Design Export 8.0軟件繪出方程的響應(yīng)面圖及等高線分析圖，響應(yīng)面分別代表兩個(gè)獨(dú)立變量之間對(duì)響應(yīng)值尿苷磷酸化酶活力的影響，并可以直接地反映出最優(yōu)值；等高線的形狀可以反映兩因素間交互作用的強(qiáng)弱大小，圓形表示交互作用不顯著，橢圓形表示交互作用顯著。由圖1可知，磷酸根-酵母粉的交互作用等高線呈橢圓形，表明磷酸根-酵母粉交互作用對(duì)尿苷磷酸化酶活影響顯著，其他因素間交互作用影響不顯著。

表6 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 6 Box-Behnken design arrangement and corresponding results

表7 響應(yīng)面回歸模型的方差分析Table 7 Analysis of variance for the response surface regression model

圖1 磷酸根與酵母粉添加量相互作用對(duì)尿苷磷酸化酶產(chǎn)量的響應(yīng)面立體分析圖與等高線圖Fig.1 Response surface and contour plots showing the interaction effects of various factors on the yield of uridine phosphorylase

2.5 模型方程的驗(yàn)證

響應(yīng)面法分析得到的最優(yōu)結(jié)果并沒有在設(shè)計(jì)的試驗(yàn)組合中，為了進(jìn)一步驗(yàn)證模型的可靠性，在最佳培養(yǎng)條件下，做5次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，得到尿苷磷酸化酶活為1.325U/mg，基本與響應(yīng)面預(yù)測(cè)的最大值1.30887U/mg符合，說明響應(yīng)面法優(yōu)化得到的數(shù)學(xué)模型與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)擬合較好。在基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵條件下，短乳桿菌產(chǎn)尿苷磷酸化酶能力為0.883U/mg，優(yōu)化后提高了50.0%。

3 結(jié) 論

提高菌體產(chǎn)酶量最有效的方法主要是通過改良微生物產(chǎn)酶培養(yǎng)基。短乳桿菌產(chǎn)尿苷磷酸化酶過程中，影響產(chǎn)酶量的因素很多，且因素之間相互聯(lián)系。本實(shí)驗(yàn)通過單因素試驗(yàn)確定了蛋白胨、磷酸根、尿苷及肌苷4個(gè)因素為促進(jìn)短乳桿菌產(chǎn)尿苷磷酸化酶的有效因子，并通過Plackett-Burman試驗(yàn)篩選出影響尿苷磷酸化酶活的顯著因子，進(jìn)而利用最陡爬坡試驗(yàn)逼近最大響應(yīng)區(qū)域，最后通過響應(yīng)面法優(yōu)化短乳桿菌產(chǎn)尿苷磷酸化酶發(fā)酵培養(yǎng)基配方為：NaCl 5g/L、葡萄糖18.30g/L、酵母粉15.71g/L、蛋白胨15g/L、磷酸根3.99g/L、肌苷20mmol/L、尿苷21.38mmol/L；發(fā)酵條件：pH8.0、搖床轉(zhuǎn)速110r/min、發(fā)酵溫度32℃、培養(yǎng)時(shí)間14h、接種量1.0%。在優(yōu)化培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，尿苷磷酸化酶活力達(dá)1.325U/mg，較優(yōu)化前的酶活力0.883U/mg提高了50.0%。以上結(jié)果表明通過響應(yīng)面法優(yōu)化短乳桿菌產(chǎn)尿苷磷酸化酶發(fā)酵培養(yǎng)基及其發(fā)酵條件是可行有效的，這為進(jìn)一步通過選育菌種、代謝調(diào)控等技術(shù)提高酶活提供了研究基礎(chǔ)。

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