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    硫酸軟骨素含量測定方法的研究進展*

    2013-02-09 00:51:52
    天津藥學(xué) 2013年2期
    關(guān)鍵詞:軟骨素光度法分光

    張 莉

    (天津市藥品檢驗所,天津 300070)

    硫酸軟骨素(chondroitin sulfate,CS)是一種天然酸性黏多糖,屬生物高分子化合物。CS有A、C和D三種異構(gòu)體,以A和C異構(gòu)體居多,其均由D-葡萄糖醛酸和N-乙酰-D-氨基半乳糖以1,3-糖苷鍵結(jié)合的雙糖為基本單位聚合而成。只是硫酸基團的位置不同,前者為4位,后者為6位。目前CS主要是從豬、牛或鯊魚等動物的喉骨和鼻中骨等軟骨中提取,其相對分子質(zhì)量10 000~50 000。CS用途廣泛,主要用在治療神經(jīng)性頭疼、偏頭痛、骨關(guān)節(jié)疾病、冠心病和心絞痛,對鏈霉素引起的聽覺障礙具有顯著的臨床效果。近年來有關(guān)硫酸軟骨素與氨基葡聚糖、玻璃酸鈉等藥物聯(lián)合使用[1,2]治療骨性關(guān)節(jié)炎的報道越來越多,制成復(fù)方制劑后其抗炎、鎮(zhèn)痛效果更加顯著。隨著對CS生理功能及其理化性質(zhì)的進一步深入研究,在醫(yī)藥制劑、日用產(chǎn)品、醫(yī)藥材料、保健品等領(lǐng)域,CS的用途將更加廣泛,越來越引起人們的重視[3]。

    1 我國現(xiàn)行的法定測定方法的應(yīng)用情況[4,5]

    現(xiàn)執(zhí)行的質(zhì)量標準[4,5]中硫酸軟骨素含量測定方法主要分為三類,即Elson-Morgan比色法、咔唑比色法和酶解-高效液相色譜法。

    1.1測定氨基己糖的Elson-Morgan比色法早在1989年,CS的質(zhì)量標準即收載于《衛(wèi)生部藥品》標準生化藥品第一分冊。后此標準又收入于1998年頒布的《衛(wèi)生部藥品標準》二部第六分冊。該法的測定原理是先將CS酸水解成氨基葡糖,然后在堿性條件下與乙酰丙酮反應(yīng),再與對二甲氨基苯甲醛進行衍生顯紅色,在525 nm波長處測定吸收度,以鹽酸氨基葡糖作對照品,計算氨基葡糖含量,進而換算成CS的含量。因此方法使用的對照品和酸水解后的產(chǎn)物有所不同,故不能真實的反映其主體結(jié)構(gòu)的真實含量,準確度較低,結(jié)果重現(xiàn)性不好。

    1.2測定葡萄糖醛酸的咔唑比色法該法收載于《國家藥品標準化學(xué)藥品地方標準上升國家標準》(第九冊),用于測定多種CS制劑。該法的測定原理是利用硫酸軟骨素中的D-葡糖醛酸在飽和硼酸溶液和四硼酸鈉硫酸溶液的共同作用下加熱生成糠醛,在0.2%咔唑無水乙醇溶液中進一步加熱顯紅色,顯色后的溶液在520 nm 波長處有最大吸收,測定時以葡糖醛酸為對照品。該法因需要水解和顯色,實驗過程較為煩瑣、復(fù)雜,而且干擾因素較多。操作過程中使用硫酸,也給操作者帶來諸多不便。雖然準確度有所提高,但專屬性仍然不是很好。

    1.3酶解-高效液相色譜法2010年版的《中國藥典》[6]采用了酶解-高效液相色譜法,用于測定 CS鈉原料、片劑和膠囊劑。采用強陰離子交換硅膠為填充劑的色譜柱,分別以水(pH 3.5)和2 mol/L氯化鈉溶液(pH 3.5) 為流動相,進行梯度洗脫,流速為1.0 ml/min,檢測波長為232 nm。用CS鈉對照品作為對照,按外標法以硫酸軟骨素A、B和C的峰面積之和計算含量。反應(yīng)的原理為CS 鈉在硫酸軟骨素 ABC 酶作用下,將硫酸軟骨素鈉酶解為硫酸軟骨素A、硫酸軟骨素C和少量硫酸軟骨素B三者的二糖單元??蓽蚀_判斷產(chǎn)品軟骨的來源,精確地反映CS 鈉的真實含量,專屬性強。

    2 CS定量分析方法

    CS定量分析方法有許多種,每種含量測定方法均有其特點,但測定原理均是根據(jù)其組成的糖單位(D-葡糖醛酸和N-乙酰-D-氨基半乳糖)、硫酸基以及酸性黏多糖的大分子性質(zhì)。

    2.1光譜法

    2.1.1分光光度法

    2.1.1.1氨基己糖的測定 測定CS含量常用為Elson-Morgan反應(yīng)法,該方法不僅操作煩瑣,而且重現(xiàn)性差。

    2.1.1.2已糖醛酸的測定 常用的方法為咔唑法,測定原理同前所述。萬秀玉等[7,8]建立咔唑法同時測定玻璃酸鈉和CS的含量。采用醋酸鈉調(diào)節(jié)樣品的酸堿度和離子強度,氯化十六烷基吡啶可選擇性使CS沉淀,而玻璃酸鈉不沉淀,從而將玻璃酸鈉和CS進行分離。樣品預(yù)處理條件為:精密量取玻璃酸鈉和CS的混合溶液10 ml,加入醋酸鈉1.6 g,12.5 mmoL/L氯化十六烷基吡啶10 ml,充分攪拌后,靜置1 h,20 μm濾膜過濾;濾液用于測定玻璃酸鈉的含量;濾餅經(jīng)1.4 mol/L氯化鈉溶液超聲解離后,用于測定CS的含量,玻璃酸鈉和硫酸軟骨素的平均回收率分別為101.2%和99.4%,RSD分別為1.05%和0.96%。說明本法可同時測定玻璃酸鈉和硫酸軟骨素的含量,相互之間無干擾。該法較測定氨基葡糖法簡單,由于操作過程中同樣使用濃硫酸,給操作者帶來諸多不便。

    2.1.1.3陽離子染料法CS在水溶液中解離帶負電荷,研究者利用這一特性分別采用一種陽離子染料吖啶橙,其在酸性條件下帶正電荷;和醌亞胺類染料中性紅,其本身也帶正電荷,兩種物質(zhì)與CS的相互作用均能形成復(fù)合物,根據(jù)其復(fù)合物溶液在特定波長處隨著吸光度降低與CS的含量成比例關(guān)系的特點,建立了一種快速、簡便、靈敏的測定CS含量的光度法。

    李明明等[9]建立了分光光度法測定CS含量。在pH 5.0醋酸-醋酸鈉緩沖溶液中,結(jié)晶紫在583 nm處有一特征吸收峰,結(jié)晶紫是一種陽離子染料,在酸性條件下帶正電荷,結(jié)晶紫結(jié)構(gòu)中的氨基帶正電荷,CS的磺酸基和羧基帶負電荷,兩者通過靜電引力和疏水作用力形成締合物,產(chǎn)生變色效應(yīng),吸光度降低兩者的吸光度差值與CS濃度在0.01~2.7 g/ml 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,平均回收率為99.7%。據(jù)此建立了一種檢測濃度范圍較大、靈敏度高、快速簡便的分光光度法測定CS含量。

    2.1.1.4間苯三酚分光光度法利用CS與含有間苯三酚的無機酸在100℃反應(yīng)30 min,生成的有色物質(zhì)在波長558 nm處有最大吸收,通過比色測定CS的含量,該方法將水解和顯色反應(yīng)一步完成,具有較好重現(xiàn)性,操作簡單。尤其適用于生產(chǎn)企業(yè)準確快速檢測CS的要求,是分光光度法測定CS比較理想的方法。

    2.1.1.5熒光分光光度法逯家輝等[10]根據(jù)在pH 5.0的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液中,結(jié)晶紫在232.0 nm光的激發(fā)下,于467.0 nm處有一個熒光峰,結(jié)晶紫分子的氨基在酸性條件下帶正電荷,CS的磺酸基和羧基帶負電荷,二者通過靜電引力和疏水作用力形成締合物,締合物在467.0 nm處熒光強度增強,且熒光強度差值與CS濃度在0.002~1.7 μg/ml范圍內(nèi)呈線性關(guān)系,建立了一種快速、簡便、準確的測定CS含量的新方法。并同時采用維多利亞藍B分光光度法進行了比較,所測的結(jié)果基本一致,用于CS類藥物的質(zhì)量檢測。

    2.1.2化學(xué)發(fā)光方法李艷平等[11]建立快速測定CS注射液的化學(xué)發(fā)光方法。方法采用Ce4+-Na2SO3-H2SO4氧化還原體系,并利用體系中加入CS后發(fā)光強度增強的原理,建立測定CS的化學(xué)發(fā)光分析方法,并與間苯三酚分光光度法進行了比較。該方法不需要分光光度法中加熱等步驟,所建方法快捷、簡便、靈敏度高,可用于CS注射液中CS含量的測定,若能選擇適當(dāng)?shù)妮腿》椒◤纳飿悠诽崛S,則可利用本方法進行體內(nèi)藥物分析。

    2.1.3共振瑞利散射光譜法李繼桃等[12]將CS與結(jié)晶紫相互作用生成復(fù)合物,該復(fù)合物分別在505和661 nm波長處有最大共振瑞利散射峰,分別用兩種波長測定了CS注射液中CS的含量。

    2.2光度滴定法利用CS可以與氯化十六烷基吡啶結(jié)合在適宜的條件下形成穩(wěn)定的混懸液的性質(zhì), 徐志洲等[13]研究建立了在420 nm波長處用光度電極指示終點,快速測定CS含量的新方法。該方法可以防止生產(chǎn)廠家非法添加氨基己糖來提高CS含量的問題,是一種簡而易行測定CS的檢測手段。

    2.3高效液相色譜法林燕飛等[14]建立以蒸發(fā)光散射為檢測器,采用高效液相色譜法測定復(fù)方氨基葡萄糖片中CS。本方法能避免鹽酸氨基葡萄糖對CS測定的干擾,分離度大于2.0,在流動相中加入0.1%的三乙胺,不僅促進CS的電離平衡, 而且使CS峰形嚴重拖尾的問題得以改善,該方法準確、快速、重復(fù)性好。

    潘自國等[15]建立了RP-HPLC法同時測定CS總含量及其A、B、C、D 4個組分含量。采用C18柱,流動相為乙腈-0.5%磷酸-異丙醇 (15∶85∶1),檢測波長209 nm,柱溫40 ℃。CS總量在0.4~2 mg/ml濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r=0.9997),方法平均回收率99.3%,RSD為1.16%。

    狄平平等[16]建立復(fù)方氨基葡萄糖片中鹽酸氨基葡萄糖和CS含量HPLC測定方法。方法均采用C18色譜柱,鹽酸氨基葡萄糖以0.68% 醋酸緩沖溶液-甲醇(82∶18)為流動相,檢測波長為340 nm,流速為1.0 ml/min,進樣量為10 μl。CS以0.005 mol/L辛烷磺酸鈉水溶液-乙腈(95∶5)為流動相,檢測波長為195 nm;流速為0.5 ml/min;進樣量為10 μl。結(jié)果鹽酸氨基葡萄糖濃度在0.5061~4.100 mg/ml范圍內(nèi)與異構(gòu)體峰面積線性關(guān)系良好,平均回收率為100.59%,RSD為1.21%(n=6)。CS的進樣濃度在170.7~1001.5 μg/ml范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好,平均回收率為99.87%,RSD為1.05%(n=6)。該方法簡便、準確,可用于本品的質(zhì)量控制。

    石瑞平等[17]采用離子對反相高效液相色譜法測定CS含量及有關(guān)物質(zhì)。該方法的檢測波長為195 nm,已接近遠紫外區(qū),甲醇和乙腈的截止波長分別為205和190 nm,故流動相選用乙腈。同時流動相中加入了0.004 mol/L辛烷對氨基苯磺酸鈉溶液。選用低濃度的離子對試劑使得CS的的分離效果更好而且基線穩(wěn)定,干擾少,主成分峰拖尾現(xiàn)象也得到了明顯改進; 該法準確、簡便,重復(fù)性好,可作為控制CS滴眼液質(zhì)量的方法。

    David等[18]利用軟骨素酶ACⅡ?qū)S酶解后,也采用離子對的液相色譜法對CS的含量進行了測定,該方法在240 nm波長處進行梯度洗脫,結(jié)果精確度高,重現(xiàn)性好,專屬性強。

    2.4電泳法電泳法樣品制備簡單、用量小,分析時間短,可應(yīng)用于CS的定量分析。電泳測定方法包括醋酸纖維素薄膜電泳法、聚丙烯酰胺凝膠電泳法和瓊脂糖凝膠電泳法等

    沈建如等[19]建立了高效毛細管電泳可以快速、準確地直接測定原料藥及片劑中CS含量的方法。方法采用區(qū)帶毛細管電泳為分離模式,操作電壓30 kV,毛細管溫度25 ℃,檢測波長200 nm,操作緩沖液為15 mol/L磷酸二氫鈉溶液(磷酸調(diào)pH至3.0),壓力進樣(50 mbar×15 s),外標法定量。所用輔料對CS片劑的定量分析無干擾,CS的出峰時間在6.5 min左右,實驗中電流噪音較小,分離效果良好。應(yīng)用范圍較廣??梢詽M足實際生產(chǎn)中的檢驗需要。

    3 展望

    CS是重要的生化藥物,具有多種生物活性,因其特有的生物活性而廣泛用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域,目前國內(nèi)外市場的需要量比較大,CS的檢測方法也多種多樣,各有其特點,應(yīng)根據(jù)要求加以選擇。分光光度法操作煩瑣,重現(xiàn)性差,且干擾因素多,需經(jīng)進一步改良,簡化操作;一般的高效液相色譜法測定時由于紫外檢測為短波長,基線噪音比較高,色譜峰容易拖尾;加入離子對試劑可以改善峰形,提高分離效果且基線穩(wěn)定,專屬性強;高效毛細管電泳專屬性強,靈敏度高,應(yīng)用范圍廣。隨著檢驗條件和設(shè)備的不斷進步,大型精密儀器的不斷引進,CS含量測定的方法也將不斷提高和完善,以滿足CS及其制劑的質(zhì)量控制的需求[20]。

    1韓剛,原海忠.氨基葡萄糖與硫酸軟骨素復(fù)方片的抗炎、鎮(zhèn)痛作用[J].中國生化藥物雜志,2010,31(1):39

    2陳磊,凌沛學(xué).硫酸軟骨素和玻璃酸鈉聯(lián)合應(yīng)用治療木瓜酶致兔膝骨關(guān)節(jié)炎[J].中國生化藥物雜志,2009,30(1)33

    3曹岳華,彭國慶.硫酸軟骨素在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用概況[J].中南藥學(xué),2010,8(3):222

    4張?zhí)烀?,凌沛學(xué).硫酸軟骨素的過去、現(xiàn)在和將來[J].食品與藥品,2010,12(1):1

    5姜玉紅,張翊.硫酸軟骨素含量測定的法定方法[J].食品與藥品,2009,11(3):68

    6中國藥典[S].二部.2010: 984-986

    7萬秀玉,白若琬.咔唑法同時測定玻璃酸鈉和硫酸軟骨素的含量[J].藥學(xué)實踐雜志 2009,27(4):282

    8萬秀玉,姜雯.含玻璃酸鈉的復(fù)方硫酸軟骨素滴眼液中硫酸軟骨素的含量測定[J].中國生化藥物雜志,2009,30(1):43

    9李明明,逯家輝.硫酸軟骨素的結(jié)晶紫分光光度法測定[J].中國醫(yī)藥工業(yè)雜志,2008,39(1):50

    10逯家輝,李明明.熒光法測定硫酸軟骨素含量的新方法[J].分析科學(xué)學(xué)報,2008,24(5):561

    11李艷平,吳擁軍.化學(xué)發(fā)光法快速測定硫酸軟骨素注射液的含量[J].華西藥學(xué)雜志,2007,22(3):331

    12李繼桃,李念兵.甲基紫硫酸軟骨素共振瑞利散射光譜及其應(yīng)用[J].分析測試學(xué)報,2007,26(2):183

    13徐志洲, 徐玉文.光度滴定法測定硫酸軟骨素的含量.中國藥品標準,2008,9(6):465

    14林燕飛,孫靜蕓. HPLC-ELSD法測定復(fù)方氨基葡萄糖片中硫酸軟骨素的含量[J].中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)雜志,2006,23(5):388

    15潘自國, 陶禮萍.硫酸軟骨素的RP-HPLC測定[J].中國醫(yī)藥工業(yè)雜志,2007,38(9):659-661

    16狄平平,勞苑子.HPLC法測定復(fù)方氨基葡萄糖片中鹽酸氨基葡萄糖和硫酸軟骨素含量[J].中國藥事,2010,24(3):283

    17石瑞平,胡海勛.離子對反相高效液相色譜法測定硫酸軟骨素滴眼液的含量及有關(guān)物質(zhì)[J].藥物分析雜志,2008,8(9):1574

    18David J I,Roman M.Determination of chondroitinsulfate content in raw materials and dietary supplements by highperformanceliquid chromatography with ultraviolet detection afterenzymatic hydrolysis: single-laboratory validation[J].J AOAC Int,2007,90(3): 659

    19沈建如,陳振德.高效毛細管電泳法測定硫酸軟骨素含量[J].中國生化藥物雜志,2010,31(3):197

    20于海洲,范慧紅.硫酸軟骨素含量測定方法研究進展[J].中國生化藥物雜志,2011,32(2):160

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