人血漿中頭孢克肟的LC-MS/MS 法測定及生物等效性研究*

王雨萍，魯卓林，尹永強(qiáng)，任晉民

(1.天津市兒童醫(yī)院，天津 300014; 2.天津醫(yī)科大學(xué)，天津 300070; 3. 河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院，石家莊 050017)

頭孢克肟為β -內(nèi)酰胺類的抗生素，是第三代廣譜口服頭孢菌素，對革蘭陽性菌和革蘭陰性菌均有抗菌活性，臨床上主要用于敏感菌所引起的肺炎、支氣管炎、泌尿道炎、膽囊炎、膽管炎、中耳炎等疾病的治療［1］。目前，常用的頭孢克肟測定方法主要有高效液相色譜法［2，3］、化學(xué)發(fā)光法［4］等，但是存在靈敏度低、專屬性差以及預(yù)處理操作煩瑣費(fèi)時等缺點(diǎn)。本文建立了人血漿樣品中頭孢克肟的LC -MS/MS 分析方法，該方法具有靈敏高、專屬性好、準(zhǔn)確的特點(diǎn)，預(yù)處理方法簡便快速，尤其適宜高通量血漿樣品頭孢克肟含量的測定，并對頭孢克肟分散片的人體內(nèi)生物等效性進(jìn)行評價(jià)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 API 4000 型液相色譜- 三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀，配有ESI 源、Analyst 1.4.2 數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)軟件(美國ABI 公司)。Shimadzu 20A 液相色譜系統(tǒng)，包括二元梯度泵、在線脫氣機(jī)、自動進(jìn)樣器和柱溫箱(日本島津公司)。AG-135 分析天平(瑞士MettLer ToLedo公司)。GZ - 20G - Ⅱ型離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)。

1.2 試藥 對照品:頭孢克肟(批號130503 -200904，以頭孢克肟計(jì)含量為86.4%)和甲磺酸酚妥拉明(批號00110 -200602，純度:99.9%)均購自中國藥品生物制品檢定所。受試制劑(A):頭孢克肟分散片(規(guī)格50 mg/片，批號100101，華北制藥秦皇島有限公司);參比制劑(R):頭孢克肟分散片(商品名世福素，規(guī)格100 mg/片，批號2100002，廣州白云山制藥總廠)。乙腈和甲酸為色譜純，水為杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜和質(zhì)譜條件 色譜條件:XDB -C8柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)，保護(hù)柱C18(4 mm×3.0 mm);流動相為乙腈- 水- 甲酸(40 ∶ 60 ∶ 0. 5);流速0. 6 ml/min;柱溫20 ℃;進(jìn)樣量20 μl。

質(zhì)譜條件:電噴霧離子化(ESI)源;噴霧電壓5500 V;霧化溫度600 ℃;霧化氣45 L/min;簾氣30 L/min;碰撞氣8 L/min;輔助氣50 L/min;檢測方式:正離子多反應(yīng)監(jiān)測(MRM);監(jiān)測離子m/z 454.3→285.2(頭孢克肟)，m/z 282.2 →212.2(酚妥拉明)，碰撞誘導(dǎo)解離電壓均為27 V;駐留時間100 ms。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液制備

2.2.1 對照品貯備液 精密稱取對照品頭孢克肟11.6 mg(相當(dāng)于頭孢克肟含量為10.0 mg)，轉(zhuǎn)移入10 ml 量瓶中，用甲醇溶解并定容，即得濃度為1.0 mg/ml的對照品貯備液。

2.2.2 對照品工作液 采用空白血漿將對照品貯備液分別稀釋成濃度為0.05、0.10、0.30、1.00、3.00 和5.00 μg/ml 的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，即為對照品工作液。

2.2.3 內(nèi)標(biāo)工作溶液 濃度50.0 ng/ml 的甲磺酸酚妥拉明乙腈溶液。

2.3 血樣預(yù)處理 取100 μl 血漿樣品，并依次加入乙腈200 μl、內(nèi)標(biāo)溶液100 μl，渦流混合30 s，低溫離心(11 000 r/min)5 min 后，轉(zhuǎn)移上清液100 μl 至2 ml 離心試管中，然后加甲酸的水溶液(0.5%)200 μl，渦流混合30 s，離心后吸取200 μl 裝入自動進(jìn)樣器小瓶，進(jìn)樣20 μl 進(jìn)行含量分析，并記錄主峰和內(nèi)標(biāo)峰面積，采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算血樣的頭孢克肟濃度(g/ml)。

2.4 專屬性試驗(yàn)及基質(zhì)效應(yīng)考查 專屬性試驗(yàn):頭孢克肟和內(nèi)標(biāo)的一級全掃描質(zhì)譜(ESI)主要生成準(zhǔn)分子離子峰［M + H］+，質(zhì)荷比分別為m/z 454. 3 和m/z 282.2。選擇性對準(zhǔn)分子離子峰進(jìn)行二級質(zhì)譜分析，用于定量分析時監(jiān)測的產(chǎn)物離子為頭孢克肟和內(nèi)標(biāo)酚妥拉明生成的主要碎片離子，分別為m/z 285.2 和m/z 212.2。分別取不同來源的6 名受試者的空白人血漿100 μl，并以甲醇代替內(nèi)標(biāo)溶液，按“2.3”項(xiàng)下方法操作;將適量頭孢克肟標(biāo)準(zhǔn)溶液加入空白人血漿中制備成濃度為5.00 μg/ml 的血漿模擬樣品，按同法操作;另取志愿受試者用藥5 h 后的血漿樣品100 μl，按同法操作。由血漿樣品按本實(shí)驗(yàn)法分離測定所得的分析色譜圖表明，空白樣品中內(nèi)源性物質(zhì)不干擾頭孢克肟的分析，通過與空白血樣添加標(biāo)準(zhǔn)對照品(頭孢克肟、酚妥拉明)色譜圖比較，測得頭孢克肟和內(nèi)標(biāo)酚妥拉明的保留時間約為2.7 和3.3 min。色譜圖見圖1。

在確立實(shí)驗(yàn)分析方法過程中，考查了基質(zhì)效應(yīng)，結(jié)果表明基質(zhì)效應(yīng)不顯著，不影響頭孢克肟和內(nèi)標(biāo)含量的準(zhǔn)確測定。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備 取適量對照品工作液，以空白血漿稀釋，分別制成濃度為5. 00、3. 00、1. 00、0. 30、0.10和0.05 μg/ml 的系列線性工作液，按“2.3”項(xiàng)下方法操作并進(jìn)行分析測定。以頭孢克肟濃度C 為橫坐標(biāo)，頭孢克肟與內(nèi)標(biāo)峰的面積之比R 為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為R =0.456 C +1.1 ×10-4(r =0.999)。結(jié)果表明，頭孢克肟在0.05 ～5.00 μg/ml 濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，最低定量限為0.05 μg/ml，準(zhǔn)確度為8.1%，RSD 為3.8%(n=6)。

2.6 方法回收率及精密度試驗(yàn) 按“2.5”項(xiàng)下方法分別制備成低、中、高3 個濃度(0. 10、1. 00 和4. 00 μg/ml)的血漿模擬樣品各6 份，共4 批次，然后分別進(jìn)樣測定，計(jì)算日內(nèi)、日間RSD，方法回收率及精密度試驗(yàn)結(jié)果見表1。同法制備低、中、高濃度(0.10、1.00和4.00 μg/ml)的血漿模擬樣品各6 份，分別測定頭孢克肟的峰面積S1 與相應(yīng)濃度頭孢克肟溶液的峰面積S2，計(jì)算頭孢克肟的提取回收率(按S1/S2 ×100%)，結(jié)果分別為94.5%、105.0 %和91.5% (n =6)。內(nèi)標(biāo)的提取回收率為101.0% (n=9)。

表1 方法回收率及精密度試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 考查濃度為0.10 和4.00 μg/ml的頭孢克肟血漿樣品分別在避光條件下室溫放置4 h、樣品處理后在室溫放置24 h、凍融3 次和凍存30 d 的穩(wěn)定性，結(jié)果表明頭孢克肟峰面積的RSD 均小于6.6%(n =6)，提示血漿樣品在上述條件下均保持穩(wěn)定。

2.8 血藥濃度分析和藥動學(xué)研究

2.8.1 研究對象20 名男性健康志愿者，年齡(22.0 ±1.9)歲，體重(65.0 ±6.0)kg，身高(173 ±5)cm，試驗(yàn)前均經(jīng)嚴(yán)格體檢證實(shí)其心、肝、腎功能及血糖等指標(biāo)正常，試驗(yàn)前2 周及試驗(yàn)期間未使用其他任何藥物，且無煙酒不良嗜好。本試驗(yàn)方案經(jīng)河北醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會審核批準(zhǔn)，所有志愿者全部簽署書面知情同意書。

2.8.2 試驗(yàn)研究方案 采用隨機(jī)分組、雙交叉、兩周期試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行本項(xiàng)研究，20 名受試者隨機(jī)分為兩組，其中一組先口服受試制劑，于間隔期1 周后服用參比制劑;另一組首先口服參比制劑，于間隔期1 周后服用受試制劑。根據(jù)頭孢克肟制劑的臨床常用劑量，確定本次試驗(yàn)研究的給藥劑量為100 mg(單劑量)。試驗(yàn)當(dāng)日早晨，受試者空腹口服試驗(yàn)藥物，飲用250 ml溫開水送服受試制劑或參比制劑，2 h 內(nèi)嚴(yán)格禁水，服藥4 h 后各進(jìn)食標(biāo)準(zhǔn)餐1 次。試驗(yàn)期間受試者保持日常輕微活動，不允許長時間臥床，并避免劇烈活動。同時受試者禁用其他藥物及含咖啡因類成分的飲料，禁止吸煙、飲酒。

圖1 頭孢克肟及內(nèi)標(biāo)的MRM 色譜圖

2.8.3 血樣采集方法 在服藥前取1 個空白血樣，再于服藥后0.75、1.5、2.25、3、4、5、7、9、11、13、15 和24 h 各個時刻采集12 個血樣，血樣采自上肢靜脈血3 ml，注入肝素化管中，混勻后離心(轉(zhuǎn)速3000 r/min)10 min，血樣于-70 ℃冰箱保存待測。

2.8.4 數(shù)據(jù)分析處理 采用DAS 2.0 程序軟件計(jì)算藥代動力學(xué)參數(shù)(權(quán)重系數(shù)選擇1)。數(shù)據(jù)處理方法:用逐個受試者的血藥濃度-時間數(shù)據(jù)作曲線擬合，首先求得個體參數(shù)再計(jì)算平均值。Tmax、Cmax取實(shí)際測得值，消除半衰期按t1/2= -0.693/Zeta 計(jì)算，藥時曲線下面積(AUC)由梯形法求得。Cmax及AUC 值經(jīng)對數(shù)轉(zhuǎn)換后進(jìn)行雙單側(cè)t 檢驗(yàn)、90%置信區(qū)間檢驗(yàn)及方差分析，Tmax用非參數(shù)法分析，評價(jià)受試與參比制劑的生物等效性。20 名受試者口服單劑量受試制劑和參比制劑的藥代動力學(xué)參數(shù)計(jì)算結(jié)果見表2，平均藥時曲線參見圖2。

表2 20 名受試者口服2 種頭孢克肟制劑的主要藥動學(xué)參數(shù)(n=20)

圖2 20 名受試者口服2 種頭孢克肟制劑后的平均藥時曲線

3 討論

頭孢克肟常用測定方法主要是HPLC 法等，雖然HPLC 法檢測靈敏度較好，但實(shí)現(xiàn)內(nèi)源性物質(zhì)與被分析物色譜分離比較困難，對樣品前處理的要求高，如使用固相萃取作為樣品提取手段［5］，預(yù)處理過程復(fù)雜、耗時;而使用高氯酸或三氯乙酸沉淀蛋白的預(yù)處理方法對色譜柱的損害較大。其他如化學(xué)發(fā)光法的方法特異性差，易受多種因素的干擾，不適用于生物樣品的檢測。本法建立了高靈敏的LC-MS/MS 法，最低定量濃度為0.05 μg/ml，在多反應(yīng)檢測模式(MRM)下，方法的專屬性好，待測組分能達(dá)到有效分離，樣品預(yù)處理方法采用乙腈沉淀蛋白，具有簡便、快速的特點(diǎn)，適用于大批量血漿樣品的頭孢克肟含量測定。

本文兩種頭孢克肟分散片的主要藥動學(xué)參數(shù)無顯著差異，與文獻(xiàn)報(bào)道［6］相似。生物等效性統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明，受試制劑頭孢克肟的AUC0-24h為94.7% ～109.1%，Cmax的90%置信區(qū)間89.3% ～105.3%。按照《中國藥典》附則的生物等效性判斷標(biāo)準(zhǔn)，受試制劑AUC 的90% 置信區(qū)間落在標(biāo)準(zhǔn)參比制劑的80% ～125%之間，Cmax落在75% ～133%之間即可認(rèn)為等效，故判定受試制劑與參比制劑具有生物等效性。受試制劑的相對生物利用度為(103.2 ±18.0)%。

1 杜旭，馮涌，曹曉云.高效液相色譜法測定頭孢克肟及其片劑和膠囊劑的含量和有關(guān)物質(zhì). 天津藥學(xué)，2009，21(3):27

2 蔡爽，馮婉玉，李發(fā)美. HPLC 法測定人血漿中頭孢克肟濃度［J］.沈陽藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，15(8):286

3 沈健，周建國. 高效液相色譜法測定頭孢克肟分散片的含量［J］. 中國藥業(yè)，2008，17(14):43

4 何樹華，何德勇. NBS-熒光素化學(xué)發(fā)光體系測定頭孢吡肟和頭孢克肟［J］. 四川師范大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，31(3):350

5 劉松青，代青，馬文秀，等. 固相萃取法用于生物樣品中頭孢克肟濃度測定的樣品準(zhǔn)備［J］. 第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2001，23(9):1088

6 林建陽，闞周密，馮婉玉. 頭孢克肟膠囊的藥物動力學(xué)及生物等效性研究［J］.中國醫(yī)藥工業(yè)雜志，2006，37 (7):480