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    刺參耐寒基因篩選cDNA文庫的構(gòu)建與分析

    2013-02-08 07:26:32李成澤王曉燕丁君常亞青
    關(guān)鍵詞:刺參文庫雜交

    李成澤,王曉燕,丁君,常亞青

    (大連海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,遼寧大連 116023)

    刺參耐寒基因篩選cDNA文庫的構(gòu)建與分析

    李成澤,王曉燕,丁君,常亞青

    (大連海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,遼寧大連 116023)

    利用抑制性消減雜交 (Suppression subtractive hybridization,SSH)技術(shù),對(duì)刺參Apostichopus japonicus耐低溫性狀相關(guān)的基因進(jìn)行研究。通過對(duì)刺參進(jìn)行低溫驟降試驗(yàn),利用SSH技術(shù)構(gòu)建刺參低溫驟降雙向消減cDNA文庫,共獲得6 800個(gè)陽性克隆,從文庫中隨機(jī)挑取1 000個(gè)陽性克隆測(cè)序,共獲得680條有效EST序列。利用Blastx軟件將測(cè)序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì),結(jié)果顯示:72個(gè)克隆與已知基因高度同源,其中有6個(gè)基因與應(yīng)激和免疫反應(yīng)相關(guān),存在于正向文庫的有4個(gè),分別為鐵蛋白、溶菌酶、類似紫海膽冷誘導(dǎo)β-RNA結(jié)合蛋白和huadl3021索轉(zhuǎn)鐵蛋白,存在于反向文庫的有2個(gè),分別為熱休克同源蛋白70和熱休克蛋白gp96;有3個(gè)基因與營養(yǎng)代謝和運(yùn)輸相關(guān),且都存在于反向文庫,分別為主要卵黃蛋白1、主要卵黃蛋白2和胰淀粉酶。研究表明,刺參低溫驟降文庫的成功構(gòu)建對(duì)闡述其耐低溫分子機(jī)制有非常重要的意義,為刺參育種和生物學(xué)研究提供了新的資料。

    刺參;耐寒基因;抑制消減雜交

    刺參Apostichopus japonicus又名仿刺參,隸屬于棘皮動(dòng)物門、海參綱、刺參科、仿刺參屬,在中國主要產(chǎn)于遼寧、山東、河北等北太平洋沿海區(qū)域,現(xiàn)已成為中國北方沿海重要的養(yǎng)殖品種之一[1]。溫度是影響刺參生存、生長發(fā)育和繁殖的重要環(huán)境因子之一,溫度太高,刺參進(jìn)入夏眠階段,溫度太低,刺參生長緩慢,嚴(yán)重時(shí)會(huì)出現(xiàn)化皮等現(xiàn)象[2]。目前,有關(guān)溫度對(duì)刺參生理生態(tài)學(xué)影響的研究多集中在夏眠期階段,董云偉等[3]對(duì)刺參溫度適應(yīng)性機(jī)制及夏眠過程中的生理機(jī)制進(jìn)行了探討;王方雨[4]研究認(rèn)為,刺參體腔液內(nèi)幾種免疫酶類活性受升溫脅迫影響顯著。而對(duì)于在越冬期中的刺參受環(huán)境因子影響的研究報(bào)道較少,有研究發(fā)現(xiàn),刺參在不同季節(jié)隨著溫度的變化,體內(nèi)的超氧化物歧化酶 (SOD)、過氧化氫酶 (CAT)活性和GST、Hsp蛋白均呈現(xiàn)出顯著的規(guī)律性變化。但僅用生理、生化理論不能解釋刺參耐寒的根本作用機(jī)理。中國北方的渤海和黃海北部,冬季受西伯利亞南下寒潮的影響,每年都會(huì)出現(xiàn)不同程度的結(jié)冰,嚴(yán)重影響了北方沿海海參養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展,一些地區(qū)海參死亡率高達(dá)80%以上,存活的海參也出現(xiàn)了嚴(yán)重化皮現(xiàn)象。因此,在基因?qū)用嫔涎芯看虆⒛秃畽C(jī)理及分子調(diào)控機(jī)制顯得尤為重要。

    抑制性消減雜交 (Suppression subtractive hybridization,SSH)技術(shù)是近年來發(fā)展起來的篩選差異基因的一項(xiàng)新技術(shù),該技術(shù)效率高、假陽性低,能夠有效分離擴(kuò)增低豐度差異表達(dá)的基因[5]。本研究中,作者利用SSH技術(shù)成功構(gòu)建了刺參低溫驟降雙向消減cDNA文庫,獲得了刺參耐寒的相關(guān)基因,為刺參的育種和生物學(xué)研究提供了新的資料。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    試驗(yàn)刺參于2011年4月采自某養(yǎng)殖場(chǎng),規(guī)格為50~60 g,暫養(yǎng)于大連海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,水溫保持在 (10±1)℃,每天定時(shí)半量換水,鹽度為31~32,正常通氣喂食,試驗(yàn)前3d停止喂食。選擇體態(tài)伸展、健康的20頭刺參用于試驗(yàn)。

    1.2 方法

    1.2.1 低溫處理 取10頭刺參進(jìn)行低溫驟降試驗(yàn),降溫程序?yàn)?0℃→8℃→6℃→4℃→2℃→0℃→-2℃,每降至一個(gè)梯度維持12 h,待溫度降至-2℃時(shí),維持12 h;另取10頭刺參于常溫(10℃)下養(yǎng)殖,作為對(duì)照。

    1.2.2 刺參組織總RNA的提取和mRNA的分離純化 從處理好的6頭刺參中取體壁、腸、呼吸樹和縱肌,用液氮瞬間冷凍,放于冰箱 (-80℃)中保存?zhèn)溆?。用Trizol試劑 (Invitrogen公司)提取4種組織的總RNA,用FastTrack?MAG mRNA isolation Kit試劑盒 (Invitrogen公司)分離mRNA,將其混合后用紫外分光光度計(jì) (Nano Drop 2000)檢測(cè)總RNA和mRNA樣品的濃度和純度。

    1.2.3 抑制性消減雜交 以低溫驟降組為試驗(yàn)方(tester),以常溫對(duì)照組為消減方 (driver)進(jìn)行正向消減;以常溫對(duì)照組為試驗(yàn)方 (tester),以低溫驟降組為消減方 (driver)進(jìn)行反向消減,具體步驟參照PCR-Select cDNA Subtraction試劑盒 (Clontech公司)說明書。分別將Tester和Driver mRNA用Super SMARTTMPCR cDNA Synthesis Kit試劑盒(Clontech公司)反轉(zhuǎn)錄成雙鏈cDNA,用RsaI充分酶切1.5 h后,將Tester cDNA平均分為兩份,分別與 Adaptor1和 Adaptor2R連接,再分別與Driver cDNA進(jìn)行第一次雜交,混合兩種雜交產(chǎn)物,然后再與新變性的Driver cDNA進(jìn)行第二次雜交。雜交產(chǎn)物以引物primer1進(jìn)行第一次PCR擴(kuò)增,將產(chǎn)物再用引物Nested primer1和2R進(jìn)行第二次PCR擴(kuò)增,使差異表達(dá)基因得到指數(shù)擴(kuò)增。

    1.2.4 雙向消減cDNA文庫的構(gòu)建 將兩次消減PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)Axygen PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化后連接到pMD-18-T載體中,再轉(zhuǎn)化至受態(tài)宿主菌 (DH-5α)中,用氨芐青霉素和藍(lán)白斑法篩選陽性克隆。

    1.2.5 消減效率的檢測(cè) 以刺參內(nèi)參基因β-actin為特異性引物:上游引物5'CGGGAAATCGTTCGTGACA 3',下游引物5'AGGACAAAGTTGGCGTACA 3',擴(kuò)增未消減和消減后的 cDNA樣品并利用Real-time PCR方法對(duì)其進(jìn)行消減效率分析。反應(yīng)程序?yàn)?94℃下預(yù)變性10 s;94℃下變性5 s,60℃下退火20 s,72℃下延伸30 s,共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。

    1.2.6 cDNA測(cè)序及EST序列分析 隨機(jī)挑選陽性克隆送英濰捷基 (上海)貿(mào)易有限公司進(jìn)行測(cè)序,利用Blastx軟件對(duì)獲得的有效 EST序列與GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 總RNA的提取及消減文庫的構(gòu)建

    按照Trizol說明書提取的總RNA經(jīng)紫外分光光度計(jì)檢測(cè) OD260nm/OD280nm,結(jié)果為1.8~2.0,說明RNA質(zhì)量較高,沒有DNA、蛋白或酚的污染。經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),28S和18S條帶清晰,二者亮度比為2∶1至2.5∶1,條帶整齊,說明RNA完整性較好。將從驟降組和對(duì)照組分離的mRNA用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)OD260nm/OD280nm,分別為1.89和2.09,質(zhì)量分別為14.9 μg和4.5 μg,滿足后續(xù)試驗(yàn)的需要。

    2.2 消減雜交及差異片段陽性克隆的PCR檢測(cè)

    用CloneMiner II cDNA Library Construction Kit試劑盒 (Invitrogen公司)合成全長dscDNA,酶切后cDNA表現(xiàn)為平均大小為100~2 000 bp的條帶,說明cDNA酶切較完全。從正反向文庫中隨機(jī)各挑取12個(gè)克隆對(duì)所建文庫進(jìn)行陽性克隆檢測(cè),結(jié)果如圖1所示。PCR檢測(cè)結(jié)果顯示,陽性克隆片段主要集中在200~800 bp,文庫中片段插入率為95%。

    圖1 消減文庫部分克隆菌落PCR檢測(cè)圖Fig.1 Electrophoresis photograph of colony PCR of some clones in subtracted library

    2.3 消減雜交效率的分析

    圖2 以β-actin基因?yàn)橹笜?biāo)檢測(cè)消減雜交效率Fig.2 Real-time PCR analysis of the subtractive hybridization efficiency by β-actin gene

    利用 Real-time PCR方法,以刺參內(nèi)參基因β-actin為特異性引物分別擴(kuò)增未消減和消減后的tester cDNA樣品。結(jié)果顯示,相同PCR循環(huán)參數(shù)下,未經(jīng)消減的cDNA在第16個(gè)循環(huán)處出現(xiàn)擴(kuò)增 (圖2-A),而消減后的cDNA在第36個(gè)循環(huán)處才出現(xiàn)擴(kuò)增 (圖2-B),差異表達(dá)基因被富集220倍,消減雜交效率較高。

    2.4 低溫驟降條件下刺參cDNA雙向消減文庫庫容量及測(cè)序

    試驗(yàn)得到刺參在低溫驟降條件下cDNA正反向消減文庫6 800個(gè)陽性克隆,從文庫中挑取1 000個(gè)陽性克隆測(cè)序,共獲得680條有效EST序列,其中正向485條,反向195條。統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表1所示。

    表1 刺參cDNA消減文庫基本數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)Tab.1 Basic data statistics of cDNA subtractive library in sea cucumber Apostichopus japonicus

    利用Blastx對(duì)獲得的有效EST序列與GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì),結(jié)果顯示,有72個(gè)克隆與已知基因序列高度同源,其中正向文庫46個(gè),反向文庫26個(gè)。

    其中有6個(gè)基因與應(yīng)激和免疫反應(yīng)相關(guān),存在于正向文庫的有4個(gè),分別為鐵蛋白、溶菌酶、紫海膽類似冷誘導(dǎo)β-RNA結(jié)合蛋白和huadl3021索轉(zhuǎn)鐵蛋白,存在于反向文庫的有2個(gè),分別為熱休克同源蛋白70和熱休克蛋白gp96;有3個(gè)基因與營養(yǎng)代謝和運(yùn)輸相關(guān),且都存在于反向文庫,分別為主要卵黃蛋白1、主要卵黃蛋白2和草魚胰淀粉酶。對(duì)已知功能基因進(jìn)行GO注釋 (http://geneontology.org/),進(jìn)一步確定基因的功能。根據(jù)功能將已知基因分為6類:能量與基礎(chǔ)代謝、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄翻譯、糖與蛋白代謝、應(yīng)激反應(yīng)和營養(yǎng)離子運(yùn)輸。部分基因功能分類結(jié)果見表2。

    本研究中,還對(duì)文庫中得到的有效EST序列進(jìn)行KEGG數(shù)據(jù)庫同源比對(duì),發(fā)現(xiàn)文庫中涉及到的主要代謝通路有:氧化磷酸化、轉(zhuǎn)運(yùn)RNA、肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)、淀粉與蔗糖代謝、鈣信號(hào)途徑、磷脂酰肌醇信號(hào)系統(tǒng)、磷酸肌醇代謝、蛋白質(zhì)代謝和鞘脂類代謝等。

    3 討論

    3.1 刺參低溫驟降消減cDNA文庫的成功構(gòu)建

    SSH技術(shù)是結(jié)合抑制PCR(suppression PCR)技術(shù)和消減雜交方法建立的一種尋找差異基因的方法。該技術(shù)在水產(chǎn)動(dòng)物研究中的應(yīng)用越來越廣泛,梁利群等[6]利用 SSH技術(shù)研究了與鯉Cyprinus carpio抗寒性狀相關(guān)的基因,成功構(gòu)建了一個(gè)低溫下差異表達(dá)基因的消減cDNA文庫;Zhao等[7]用SSH技術(shù)篩選了刺參再生和高溫脅迫過程中一系列差異表達(dá)的基因;王曉燕等[8]利用兩種降溫模式探討了其對(duì)刺參免疫酶、可溶性蛋白和可溶性糖的影響,發(fā)現(xiàn)CAT和SOD的活性隨溫度的降低都產(chǎn)生了較為明顯的變化,不同的降溫幅度對(duì)可溶性糖和可溶性蛋白的含量有顯著的影響。

    生物機(jī)體對(duì)低溫環(huán)境的適應(yīng)是一個(gè)復(fù)雜的機(jī)體自身調(diào)節(jié)過程。劉偉等[9]探討了低溫對(duì)不同群體刺參體腔液中非特異性免疫酶CAT、SOD和過氧化物酶 (POD)活力的影響,發(fā)現(xiàn)“水院1號(hào)”刺參群體較大連養(yǎng)殖刺參群體對(duì)低溫的反應(yīng)更靈敏,保護(hù)機(jī)體免受氧化損傷的能力更強(qiáng)。此外,冷血?jiǎng)游镎{(diào)節(jié)細(xì)胞膜流動(dòng)性機(jī)制表明,低溫脅迫會(huì)增加膜磷脂的多不飽和脂肪來保持膜的流動(dòng)性[10]。本研究中,筆者首次建立了刺參低溫驟降cDNA文庫,正反向消減文庫共獲得6 800個(gè)陽性克隆,680條有效EST序列,包括與刺參免疫、應(yīng)激、營養(yǎng)代謝和運(yùn)輸?shù)认嚓P(guān)的基因,為解析低溫條件下刺參生理、生化變化過程的分子機(jī)理,以及獲得低溫與刺參生理代謝的相關(guān)信息提供了堅(jiān)實(shí)的分子依據(jù)。

    3.2 正向和反向cDNA文庫基因分析

    本研究中構(gòu)建的刺參耐寒正向cDNA文庫及上調(diào)表達(dá)的基因有鐵蛋白 (ferritin)、轉(zhuǎn)鐵蛋白(Transferrin,又稱為鐵傳遞蛋白、運(yùn)鐵蛋白)、溶菌酶、類似海膽冷誘導(dǎo)β-RNA結(jié)合蛋白。

    鐵蛋白廣泛存在于動(dòng)植物和微生物體內(nèi),是一種鐵儲(chǔ)存和生物礦化蛋白,它的表達(dá)調(diào)控可以維持機(jī)體內(nèi)的鐵平衡[11]。鐵蛋白也是細(xì)胞抵抗應(yīng)激和炎癥的一種蛋白,在機(jī)體免疫中起著一定的作用。有研究表明,在刺參胚胎發(fā)生、個(gè)體發(fā)育的各個(gè)階段,以及幼參腸道、體腔細(xì)胞、呼吸樹和體壁各組織中均有鐵蛋白表達(dá)[12]。

    轉(zhuǎn)鐵蛋白是機(jī)體鐵的運(yùn)輸者,已有研究證實(shí),淡水養(yǎng)殖魚類轉(zhuǎn)鐵蛋白具有耐低氧的特性,并與棲息水層有密切關(guān)系[13]。轉(zhuǎn)鐵蛋白在抗菌、殺菌和調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化與凋亡過程中發(fā)揮重要作用。本研究中,刺參在低溫環(huán)境下鐵蛋白和轉(zhuǎn)鐵蛋白上調(diào)表達(dá),推測(cè)其原因是機(jī)體為應(yīng)對(duì)低溫脅迫需要更多鐵蛋白維持機(jī)體正常生長和代謝。

    溶菌酶是水產(chǎn)動(dòng)物抵御病原菌的一種非常重要的先天性免疫防御蛋白[14],它是一類微小的普遍存在的抗菌酶,能夠催化分解N-乙酰胞壁酸和N-乙酰葡糖胺的 β-1,4-糖苷鍵,導(dǎo)致溶菌作用。溫度變化會(huì)顯著影響刺參體腔液中溶菌酶的活性,以維持機(jī)體保持正常生活狀態(tài)。本研究中,低溫脅迫引起溶菌酶上調(diào)表達(dá),以使機(jī)體適應(yīng)外界低溫環(huán)境。

    本研究中,在正向cDNA文庫中還發(fā)現(xiàn)了一個(gè)與紫海膽冷誘導(dǎo)RNA結(jié)合蛋白 (CIRP)高度同源的蛋白。CIRP最初是從小鼠的睪丸細(xì)胞中被分離鑒定的,CIRP具有介導(dǎo)冷誘導(dǎo)的細(xì)胞生長抑制作用[15]。目前,研究者已從小鼠、人類、非洲爪蟾、鮭魚和紫海膽等多種生物細(xì)胞中分離出了CIRP的cDNA。其不僅參與人和動(dòng)物冷應(yīng)激過程,而且可能參與人和動(dòng)物滲透應(yīng)激、缺氧應(yīng)激、胚胎發(fā)育、腫瘤發(fā)生,以及動(dòng)物冬眠等多種生理過程[16]。

    本研究中,反向cDNA文庫及下調(diào)表達(dá)的基因有刺參熱休克同源蛋白70和熱休克蛋白gp96、刺參主要卵黃蛋白1、刺參主要卵黃蛋白2和胰淀粉酶。

    熱休克蛋白 (Heat shock protein,Hsp)作為分子伴侶,在應(yīng)對(duì)極高或極低溫度、低氧、氧化自由基、重金屬和細(xì)菌感染過程中,機(jī)體產(chǎn)生可誘導(dǎo)熱休克蛋白,能修復(fù)變性蛋白質(zhì),加快恢復(fù)正常蛋白的形成,并且Hsp具有免疫調(diào)節(jié)和提高免疫細(xì)胞識(shí)別病原體的作用[17]。目前,在水產(chǎn)領(lǐng)域中研究Hsp與溫度耐受性方面的報(bào)道較多,Dong等[18]對(duì)刺參分別進(jìn)行高溫和滲透壓脅迫的研究表明,刺參Hsp70基因均上調(diào)表達(dá)。也有研究表明,隨著溫度驟升和驟降,Hsp70表達(dá)量表現(xiàn)為先增加后降低的趨勢(shì)[19]。

    熱休克同源蛋白 70(Heat shock cognate,Hsc70)作為Hsp70家族的成員,也具有Hsp70增強(qiáng)機(jī)體耐受性的能力[20-21],本研究中首次發(fā)現(xiàn),在低溫環(huán)境下刺參Hsc70和gp96下調(diào)表達(dá),推測(cè)是由于刺參在耐寒脅迫過程中已經(jīng)產(chǎn)生了大量Hsc70應(yīng)對(duì)低溫環(huán)境,不需要一直過量表達(dá),而且過量表達(dá)會(huì)產(chǎn)生一些負(fù)作用[22],會(huì)減少或者延緩生長和細(xì)胞分裂,降低繁殖能力,因此表現(xiàn)為下調(diào)表達(dá)。

    主要卵黃蛋白 (major yolk protein,MYP)是存在于海膽卵中最豐富的一種蛋白,經(jīng)比對(duì)發(fā)現(xiàn),海膽MYP的cDNA序列與一些鐵傳遞家族蛋白具有較高同源性[23]。Fujiwara等[24]于 2010 年克隆了日本刺參MYP,其與海膽MYP具有30%同源性,將其分為AjMYP1和AjMYP2,并且發(fā)現(xiàn)這兩種MYP在刺參各個(gè)組織和器官中均有表達(dá),是運(yùn)輸?shù)鞍?。本研究中,刺參兩種MYPs在低溫環(huán)境下下調(diào)表達(dá),推測(cè)其原因是刺參在低溫環(huán)境下進(jìn)入類似“冬眠”時(shí)期,活動(dòng)能力減弱,不需運(yùn)輸過多營養(yǎng)物質(zhì),因此,MYPs作為運(yùn)輸?shù)鞍妆憩F(xiàn)為下調(diào)表達(dá)。

    淀粉酶是刺參的主要消化酶,刺參消化道中均能檢測(cè)到淀粉酶活性[25]。胰淀粉酶作為刺參主要消化酶在低溫環(huán)境下表現(xiàn)為下調(diào)表達(dá),說明刺參代謝耗能過程減緩。

    本研究結(jié)果表明,低溫驟降雙向消減cDNA文庫中均涉及到較多的免疫、應(yīng)激和營養(yǎng)運(yùn)輸相關(guān)的基因,這些功能基因編碼的產(chǎn)物有結(jié)構(gòu)蛋白、生物調(diào)節(jié)蛋白、酶、抑制劑、受體等,參與多個(gè)代謝和信號(hào)通路。筆者將繼續(xù)用各種降溫模式脅迫刺參,并以此為切入點(diǎn)對(duì)刺參不同組織內(nèi)基因表達(dá)量進(jìn)行研究,以期從基因?qū)用嫔详U釋刺參應(yīng)答低溫脅迫的復(fù)雜機(jī)制。

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    Construction and analysis of subtracted cDNA library of sea cucumberApostichopus japonicusunder low temperature stress

    LI Cheng-ze,WANG Xiao-yan,DING Jun,CHANG Ya-qing
    (Key Laboratory of Mariculture& Stock Enhancement in North China's Sea,Ministry of Agriculture,Dalian Ocean University,Dalian 116023,China)

    Suppression subtractive hybridization(SSH)was used to analyze the differences in expression of genes related to low temperature resistance in sea cucumberApostichopus japonicus,induced by low temperature,in order to understand the molecular response.A total of 6 800 clones was obtained in the forward and reverse library of the sea cucumber exposed to the sharp decrease in temperature.Among the clones,1 000 clones was selected and analyzed,and 680 distinct EST sequences were obtained,with 72 clones sharing similarity to the sequences in Genbank databases by Blaster.There were 6 genes related to the stress and immune response,including 4 of ferritin,lysozyme,similar to cold inducible RNA-binding protein beta,and isolate huadl3021 melanotransferrin mRNA in the forward library and the other 2 of heat shock cognate 70,heat shock protein gp96 in the reverse library.There were 3 genes related to nutrition in the reverse library,including major yolk protein 1,major yolk protein 2 and pancreatic amylase.The findings suggest that cold stress have significant effects on gene expression,and provide the basis for further study of molecular regulation mechanisms underlying the response to cold in sea cucumber.

    Apostichopus japonicus;gene for cold temperature stress;suppression subtractive hybridization

    S917.4

    A

    2095-1388(2013)06-0522-06

    2013-03-21

    國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目 (31072230);國家海洋局海洋公益項(xiàng)目 (201105016-3);遼寧省重大科技專項(xiàng) (2011203003);國家“863”計(jì)劃重大項(xiàng)目 (2012AA10A412)

    李成澤 (1988-),女,碩士研究生。E-mail:chengze8023@163.com

    常亞青 (1967-),男,教授。E-mail:yqchang@dlou.edu.cn

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