地榆鞣質(zhì)的制備及其對(duì)環(huán)磷酰胺致小鼠白細(xì)胞減少癥影響的初步研究

楊金輝，楊明，黃晶，張薷云

地榆鞣質(zhì)的制備及其對(duì)環(huán)磷酰胺致小鼠白細(xì)胞減少癥影響的初步研究

楊金輝，楊明，黃晶，張薷云

目的 制備地榆鞣質(zhì)提取物，觀察其對(duì)白細(xì)胞減少癥的影響。

方法 采用明膠沉淀丙酮解析法制備地榆鞣質(zhì)提取物。選用KM 小鼠，按體重和性別隨機(jī)分成空白組、模型組、陽(yáng)性組（rhG-CSF 組）和地榆鞣質(zhì)高、中、低劑量（20、10、5 mg/kg）組，用環(huán)磷酰胺復(fù)制小鼠白細(xì)胞減少癥模型，并以白細(xì)胞數(shù)（WBC）、脾臟系數(shù)和骨髓 DNA 含量作為檢測(cè)指標(biāo)，研究地榆鞣質(zhì)的升白作用。

結(jié)果 所制地榆鞣質(zhì)純度達(dá) 90%；藥理研究顯示，地榆鞣質(zhì)高、中、低劑量組均能顯著升高白細(xì)胞數(shù)量（P ＜ 0.05），且地榆鞣質(zhì)高、中劑量組升高骨髓 DNA 的作用優(yōu)于陽(yáng)性藥（rhG-CSF）組。

結(jié)論 采用明膠沉淀丙酮解析制備法可獲得純度較高的鞣質(zhì)部位，鞣質(zhì)具有顯著的升高白細(xì)胞及保護(hù)骨髓 DNA 的作用。

地榆屬； 白細(xì)胞減少； 鞣質(zhì)

地榆，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，為薔薇科植物地榆 Sanguisorba officinalis L.或長(zhǎng)葉地榆 Sanguisorba officinalis L.var.longifolia (Bert.) Yü et Li 的干燥根，味苦、酸、澀，性微寒，歸肝、大腸經(jīng)，具有解毒斂瘡、涼血止血的功效。地榆含有多種化學(xué)成分，其中含量較多的有鞣質(zhì)與酚酸類(lèi)、三萜及皂苷類(lèi)、黃酮類(lèi)等[1-2]?，F(xiàn)代研究表明地榆有止血、抗炎、抗菌、抗腫瘤、抗氧化、鎮(zhèn)吐、止瀉、治療燒燙傷、抗?jié)兗霸鰪?qiáng)免疫功能等功效[3-4]。地榆鞣質(zhì)用于出血、潰瘍、創(chuàng)傷、灼傷等由來(lái)已久，但用于升高白細(xì)胞的研究卻鮮有報(bào)道。

本文擬以明膠沉淀丙酮解析法制備地榆鞣質(zhì)，并研究其對(duì)環(huán)磷酰胺致小鼠白細(xì)胞減少癥的治療作用，為臨床研究開(kāi)發(fā)具有升白保髓雙重功效的中藥制劑提供藥理學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥材 地榆，批號(hào)：101205，購(gòu)自四川科倫天然藥業(yè)有限公司，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院生藥教研室盧先明教授鑒定為薔薇科植物地榆的干燥根。

1.1.2 動(dòng)物 KM 小鼠，SPF 級(jí)，雌雄各半，18 ～22 g，購(gòu)自成都達(dá)碩生物科技有限公司，合格證號(hào)：SCXK（川）2004-15。

1.1.3 設(shè)備 UV-1700 型紫外分光光度計(jì)購(gòu)自日本島津公司；RE2000B 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀購(gòu)自上海亞榮生化儀器廠；ALPHAi-4LSC 冷凍干燥機(jī)購(gòu)自德國(guó)Christ 公司；BP211D 電子分析天平（十萬(wàn)分之一）購(gòu)自德國(guó) Sartorius 公司；MEK-6318 全自動(dòng)血球計(jì)數(shù)儀購(gòu)自日本光電工業(yè)株式會(huì)社；酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)賽默飛世爾公司。

1.1.4 試劑及藥品 沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品，批號(hào)：110831-200803，購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所；明膠、乙酸乙酯、丙酮均為分析純；注射用環(huán)磷酰胺，批號(hào)：10051521，為江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司產(chǎn)品；重組人粒細(xì)胞集落刺激因子注射劑（rhG-CSF），規(guī)格：75 μg，批號(hào)：201007YA05，為華北制藥金坦生物技術(shù)股份有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 地榆鞣質(zhì)提取物制備 取藥材 200 g，粉碎成粗顆粒，加 10 倍量 70% 丙酮，超聲提取 2 次，每次 1 h，過(guò)濾提取液，濾液 45 ℃ 減壓回收丙酮至完全，得濃縮液 A；將 A 加水后放置 1 h，過(guò)濾去沉淀，濾液用水飽和乙酸乙酯萃取 2 次，收集萃取液，45 ℃ 減壓回收乙酸乙酯至完全，得濃縮液 B；將 B 置 45 ℃ 水浴揮干溶劑，45 ℃ 真空干燥，即得粗品鞣質(zhì)。取上述粗品鞣質(zhì)，加水溶解，靜置后過(guò)濾去沉淀，濾液置于蒸發(fā)皿中，緩慢噴入明膠溶液，靜置，待沉淀完全后，收集沉淀，冷凍干燥 12 h 后取出，研磨成細(xì)粉，用 90% 丙酮超聲提取 2 h，藥液于 45 ℃ 減壓回收至完全，傾出濃縮液，45 ℃ 真空干燥，即得純化鞣質(zhì)。

1.2.2 含量測(cè)定 參考《中國(guó)藥典》2010年版一部附錄 XB 鞣質(zhì)含量測(cè)定項(xiàng)下方法制備。

⑴對(duì)照品溶液的制備：稱(chēng)取沒(méi)食子酸對(duì)照品48.30 mg，置 100 ml 棕色容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，量取 5 ml，置 50 ml 棕色容量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，即得（每 1 ml 中含沒(méi)食子酸 0.0483 mg）。

⑵標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制備：精密量取對(duì)照品溶液 0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 ml，分別置 25 ml 棕色容量瓶中，各加入磷鉬鎢酸試液 1 ml，再分別加水11.5、11、10、9、8、7 ml，用 29% 碳酸鈉溶液稀釋至刻度，搖勻，放置 30 min，以相應(yīng)的試劑為空白，參照《中國(guó)藥典》2010年版一部附錄 VA 紫外-可見(jiàn)光光度法，在 760 nm 的波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

⑶供試品溶液的制備：取 3 份純化鞣質(zhì)，各0.1 g，精密稱(chēng)定，置 250 ml 棕色容量瓶中，加水150 ml，放置過(guò)夜，超聲處理 10 min，放冷，用水稀釋至刻度，搖勻，靜置，濾過(guò)，棄去初濾液，取續(xù)濾液 20 ml，置 100 ml 棕色容量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，即得。

⑷鞣質(zhì)含量測(cè)定

總酚：量取供試品溶液 2 ml，置 25 ml 棕色容量瓶中，參照標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制備項(xiàng)下的方法，自“加入磷鉬鎢酸試液 1 ml”起，加水 10 ml，依法測(cè)定吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)讀出供試品溶液中沒(méi)食子酸的量（mg），樣品中總酚含量以沒(méi)食子酸計(jì)。

不被吸附的多酚：精密量取供試品溶液 25 ml，加至已盛有干酪素 0.6 g 的 100 ml 具塞錐形瓶中，密塞，置 30 ℃ 水浴中保溫 1 h，時(shí)時(shí)振搖，取出，放冷，搖勻，濾過(guò)，棄去初濾液，精密量取續(xù)濾液 2 ml，置 25 ml 棕色容量瓶中，參照標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制備項(xiàng)下的方法，自“加入磷鎢酸試液 1 ml”起，加水 10 ml，依法測(cè)定吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)中讀出供試品溶液中沒(méi)食子酸的量（mg），計(jì)算，即得。

按下式計(jì)算鞣質(zhì)的含量：鞣質(zhì)含量 = 總酚量 － 不被吸附的多酚量。

1.2.3 鞣質(zhì)部位對(duì)白細(xì)胞減少癥的影響

1.2.3.1 樣品溶液配制 取上述鞣質(zhì)純品，加水溶解配制成總鞣質(zhì)濃度為 1 mg/ml 的溶液，依次稀釋制成總鞣質(zhì)濃度為 0.5、0.25 mg/ml 的溶液，即得高、中、低濃度樣品溶液。

1.2.3.2 實(shí)驗(yàn)分組及給藥 動(dòng)物適應(yīng)性喂養(yǎng) 3 d后，按體重隨機(jī)分為 5 組，每組 10 只，分為：①模型組：等體積純凈水；②陽(yáng)性對(duì)照組（rhGCSF）：皮下注射 30 μg/(kg·d)；③～⑤地榆鞣質(zhì)高、中、低劑量組：20、10、5 mg/kg，另取 10 只正常小鼠作為空白對(duì)照組⑥。除陽(yáng)性組，其余各組小鼠按體重、劑量灌胃給予藥物或純凈水，連續(xù) 7 d。1.2.3.3 模型復(fù)制 第 8 天空白組腹腔注射給予等體積生理鹽水外，其余各組按小鼠當(dāng)日體重腹腔注射環(huán)磷酰胺 80 mg/(kg·d)，連續(xù) 3 d。除陽(yáng)性組外，從造模當(dāng)日起繼續(xù)灌胃給藥 6 d。陽(yáng)性組造模結(jié)束后開(kāi)始連續(xù)皮下注射 rhG-CSF 3 d。1.2.3.4 指標(biāo)檢測(cè)及方法

白細(xì)胞（WBC）數(shù)目測(cè)定：造模結(jié)束后第 4 天，毛細(xì)管眼眶采血 20 μl，用加有 2 ml 稀釋劑和50 μl 1% 的肝素鈉溶液稀釋后，采用全自動(dòng)血球計(jì)數(shù)儀檢測(cè)外周血白細(xì)胞數(shù)目。

脾臟系數(shù)計(jì)算：脫頸椎處死動(dòng)物，解剖取脾臟稱(chēng)重，計(jì)算脾臟重量系數(shù)。

脾臟重量系數(shù) = 脾臟重量/體重 × 100%

骨髓 DNA 含量測(cè)定[5]：剖取左側(cè)完整股骨，用醫(yī)用紗布除凈軟組織，用 0.005 mol/L CaCl210 ml將全部骨髓沖入試管中，置 4 ℃ 冰箱 30 min，2500 r/min 離心 15 min，棄去上清，將沉淀物加0.2 mol/L HClO45 ml 充分混勻，90 ℃ 水浴加熱15 min，放冷后 3500 r/min 離心 10 min，取上清，用酶標(biāo)儀于 260 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定 OD 值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 地榆鞣質(zhì)含量測(cè)定結(jié)果

2.1.1 鞣質(zhì)含量標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn) 地榆鞣質(zhì)含量測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)及線(xiàn)性范圍結(jié)果見(jiàn)圖 1 和表 1。

回歸方程為：Y = 0.1181X + 0.0465，r2=0.9998，表明地榆鞣質(zhì)在 0.966 ～ 9.660 μg/ml 濃度范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好。

表 1 地榆鞣質(zhì)含量測(cè)定線(xiàn)性和范圍Figure 1 Burnet tannin content determination of linearity and range

2.1.2 鞣質(zhì)含量測(cè)定結(jié)果 以沒(méi)食子酸計(jì)，地榆總鞣質(zhì)含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表 2。

2.2 地榆鞣質(zhì)升白作用結(jié)果

由表 3 可知，與空白組比較，模型組小鼠外周血白細(xì)胞數(shù)目、脾臟系數(shù)和骨髓 DNA 含量均顯著降低（P ＜ 0.05）。與模型組比較，地榆鞣質(zhì)高、中、低劑量組均可顯著升高白細(xì)胞數(shù)量（P ＜ 0.05），地榆鞣質(zhì)高、中劑量組均可顯著提高脾臟系數(shù)（P ＜0.05）和骨髓 DNA 含量（P ＜ 0.05）。rhG-CSF 對(duì)WBC、脾臟系數(shù)也起到明顯作用（P ＜ 0.05），但對(duì)骨髓 DNA 含量反而起到反作用；由此可見(jiàn)，地榆鞣質(zhì)具有明顯的升高 WBC 和保護(hù)骨髓的作用，且在保護(hù)骨髓 DNA 方面，地榆鞣質(zhì)的效果優(yōu)于rhG-CSF。

圖 1 地榆鞣質(zhì)含量測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Figure 1 Burnet tannin content determination standard curve

3 討論

本文鞣質(zhì)的制備過(guò)程采用了“丙酮提取、乙酸乙酯萃取、明膠沉淀和丙酮解析”的基本原理。在制備過(guò)程中提取溫度不宜過(guò)高，溫度過(guò)高易造成鞣質(zhì)縮合；藥液應(yīng)控制在適宜的濃度范圍，防止在絮凝過(guò)程中因濃度過(guò)高造成包裹進(jìn)入其他雜質(zhì)；沉淀鞣質(zhì)時(shí)，明膠的用量控制在使藥液呈蛋清狀即可；此外，要嚴(yán)格控制解析溫度，否則加熱會(huì)使明膠沉淀物粉末發(fā)生軟化、聚集，將鞣質(zhì)包裹在內(nèi)難以解析，采用超聲最佳，并注意換水。

鞣質(zhì)含量測(cè)定時(shí)，因磷鉬鎢酸鈉試液配置流程繁瑣，操作易失誤，故而在配置該試液時(shí)一定要嚴(yán)格按照藥典要求，此外，該試液放置一段時(shí)間會(huì)變成綠色，需要加入 0.2 ml 溴，并煮沸 15 min，放冷，加水定溶至煮沸前體積，待變?yōu)辄S色方可使用。

表 2 地榆鞣質(zhì)含量測(cè)定結(jié)果Table 2 Burnet total tannin content determination results

表 3 地榆鞣質(zhì)升白作用結(jié)果（±s ，n = 10）Table 3 Results of Burnet tannin elevating WBC effect (±s , n = 10)

表 3 地榆鞣質(zhì)升白作用結(jié)果（±s ，n = 10）Table 3 Results of Burnet tannin elevating WBC effect (±s , n = 10)

注：與模型組比 *P ＜ 0.05。Notes: Compared with the model group *P ＜ 0.05.

組別Groups白細(xì)胞（109/L）WBC (109/L)脾臟重量系數(shù)（mg/10g）Spleen weight coefficient (mg/10g)骨髓 DNA 含量（μg）Bone marrow DNA content (μg)空白 Blank 6.18 ± 0.44 32.18 ± 4.01 121.87 ± 8.11模型 Model 2.24 ± 0.29 19.56 ± 2.99 67.85 ± 5.63陽(yáng)性 Positive（rhG-CSF） 6.75 ± 0.46* 30.90 ± 4.20* 56.29 ± 3.67低劑量 Low dose 3.97 ± 0.39* 24.16 ± 3.01 87.22 ± 3.26中劑量 Middle dose 4.55 ± 0.47* 26.86 ± 4.23* 94.28 ± 7.98*高劑量 High dose 4.92 ± 0.74* 28.44 ± 4.20* 116.32 ± 8.93*

環(huán)磷酰胺作為雙功能烷化劑，能夠非特異性的作用于細(xì)胞周期，干擾 DNA 和 RNA 的功能，其強(qiáng)烈的烷化作用能與 DNA 發(fā)生交叉聯(lián)結(jié)，從而抑制 DNA 的合成。骨髓是重要的造血器官，小鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺后，骨髓造血細(xì)胞 DNA 合成被抑制，造成生血不足，連續(xù)大劑量給予環(huán)磷酰胺可造成骨髓造血抑制，白細(xì)胞生成不足，從而形成白細(xì)胞減少癥。課題組在前期對(duì)造模方法進(jìn)行了預(yù)試優(yōu)化，按動(dòng)物當(dāng)日體重給予環(huán)磷酰胺 80 mg/(kg·d)，連續(xù)腹腔注射 3 d，于造模給藥后的第 4 天取血檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)白細(xì)胞減少了約 2/3。給予地榆鞣質(zhì)后，在短時(shí)間內(nèi)（約 72 h），白細(xì)胞迅速升高，約可升高到原來(lái)的 80%，表明該方法可行。

rhG-CSF 能夠通過(guò)刺激骨髓多功能造血干細(xì)胞，促進(jìn)其分化、成熟、釋放，從而在短時(shí)間內(nèi)達(dá)到快速升白的效果，防止由于患者免疫力低下造成一系列的并發(fā)癥。但由于環(huán)磷酰胺對(duì)骨髓造血功能的破壞作用，骨髓造血功能本身受到抑制，加上rhG-CSF“飲鴆止渴”式的治療作用，會(huì)使患者生血功能越發(fā)衰弱。相對(duì)于 rhG-CSF 單純的升白作用，地榆鞣質(zhì)對(duì)環(huán)磷酰胺所致的骨髓 DNA 含量減少也有顯著保護(hù)作用（P ＜ 0.05），從而從根本上改善了白細(xì)胞減少的癥狀，且其升白效果呈現(xiàn)量效關(guān)系，具有“標(biāo)本兼治”的作用。

臨床研究表明，地榆升白片對(duì)于放療患者白細(xì)胞減少癥具有明顯的預(yù)防作用[6]，其對(duì)白細(xì)胞減少癥的治療作用也收到了明顯的臨床效果[7-8]。高小平等[9]通過(guò)體外培養(yǎng)小鼠骨髓造血細(xì)胞及在體實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)地榆升白的主要有效部位是地榆皂苷，且主要升高小鼠骨髓有核細(xì)胞和外周血白細(xì)胞、紅細(xì)胞及血小板的數(shù)量；系對(duì)外周血象整體都有改善作用。筆者研究結(jié)果表明地榆鞣質(zhì)主要能顯著升高白細(xì)胞數(shù)量和骨髓 DNA 含量，且對(duì)脾體重系數(shù)也有升高作用；系對(duì)白細(xì)胞特異性的升高作用，此外前期研究結(jié)果表明，地榆鞣質(zhì)對(duì)外周血紅細(xì)胞、血小板及血紅蛋白含量影響較小，無(wú)顯著的改善作用。

因此，地榆鞣質(zhì)作為一種能穩(wěn)定、快速升高白細(xì)胞并兼具骨髓造血保護(hù)作用的化學(xué)物質(zhì)，極具市場(chǎng)前景和科研價(jià)值。筆者擬就地榆鞣質(zhì)的升白作用做進(jìn)一步的研究，以期奠定其升白的物質(zhì)基礎(chǔ)。

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Preparation of Burnet tannins and preliminary study of its influence on Leukopenia in mice induced by cyclophosphamide

YANG Jin-hui, YANG Ming, HUANG Jing, ZHANG Ru-yun

ObjectiveTo prepare Burnet tannins extracts and observe its influence on Leukopenia.

MethodsGelatin precipitation and acetone resolution methods were used to prepare Burnet tannins extracts.Mice of KM species were randomly classified into blank group, model group, positive group (rhG-CSF), and high, middle and low dosage (20, 10, 5 mg/kg) of tannins group, according to weight and gender.The leucopenia mice model was made by cyclophosphamide treatment, and white blood cells (WBC) number, spleen index and bone marrow DNA content were measured to test tannins’ effect on the WBC.

ResultsThe purity of Burnet tannins extracts by this method reached about 90%.Pharmacological studies showed that WBC numbers in all of the three tannins groups can significantly be elevated (P ＜ 0.05), and bone marrow DNA contents in tannins group of high and middle dosage (20 mg/kg, 10 mg/kg) are better than that in rhG-CSF group.

ConclusionsHigher purity of Burnet tannins can be extracted by method of gelatin precipitation and acetone resolution, and the Burnet tannins can significantly elevate WBC and protect bone marrow DNA.

Sanguisorba; Leukopenia; Tannins

YANG Ming, Email:Yangming16@126.com

www.cmbp.net.cn 中國(guó)醫(yī)藥生物技術(shù), 2013, 8(1):41-45

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2013.01.009

611137 成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院（楊金輝、黃晶、張薷云）；330004 南昌，江西中醫(yī)學(xué)院（楊明）

楊明，Email：Yangming16@126.com

2012-10-22

Author Affiliations: Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 611137, China (YANG Jin-hui, HUANG Jing,ZHANG Ru-yun); Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine, Nanchang 330004, China (YANG Ming)

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