全血細(xì)胞減少性疾病的染色體培養(yǎng)

劉文剛 羅明霞

全血細(xì)胞減少（Pancytopenia，PCP）是指外周血中的三種有形成份紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血小板均低于正常值，是各種疾病造成的一種外周血象的改變[1]。多種疾病外周血可呈全血細(xì)胞減少，臨床主要表現(xiàn)為貧血、出血、感染。全血細(xì)胞減少癥不是一個(gè)獨(dú)立的疾病，它是一組高度異質(zhì)性疾病在某一側(cè)面的共同表現(xiàn)。按病理生理的不同全血細(xì)胞減少可分為由造血系統(tǒng)引起的全血細(xì)胞減少和非造血系統(tǒng)疾病引起的全血細(xì)胞減少，造血系統(tǒng)引起的全血細(xì)胞減少常見(jiàn)于再生障礙性貧血（AA）、低增生性白血病、惡性組織細(xì)胞?。◥航M）、骨髓纖維化、脾功能亢進(jìn)、骨髓增生異常綜合征（MDS）、多發(fā)性骨髓瘤（MM），非造血系統(tǒng)疾病引起的全血細(xì)胞減少常見(jiàn)于淋巴瘤、陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿（PNH）、血栓性血小板減少性紫癜、骨髓轉(zhuǎn)移癌等。骨髓生成障礙可進(jìn)一步分為非克隆增殖性疾病與克隆增殖性疾[2]。全血細(xì)胞減少性疾病臨床并不少見(jiàn)，常見(jiàn)于血液病，亦可見(jiàn)于其他疾病，因涉及疾病甚多，其診斷難在病因?qū)W診斷，應(yīng)結(jié)合臨床、血象、骨髓象、染色體等相關(guān)檢查對(duì)全血細(xì)胞減少性疾病做出診斷。

目前，制備骨髓細(xì)胞染色體的方法主要有直接法、短期培養(yǎng)法和同步法。同步法操作技術(shù)要求高、分裂指數(shù)低，不易推廣[3]。隨著熒光原位雜交技術(shù)（FISH）及基因組雜交技術(shù)的應(yīng)用于臨床研究，拓展了染色體的檢查范圍，提高了識(shí)別異常染色體的能力，但因熒光試劑和檢測(cè)設(shè)備昂貴難易廣泛應(yīng)用于臨床。筆者介紹一種改良的染色體培養(yǎng)方法，應(yīng)用在培養(yǎng)體系中加入G-CSF的方法對(duì)480例全血細(xì)胞減少性疾病進(jìn)行骨髓染色體檢查，獲得了滿(mǎn)意的結(jié)果。人們認(rèn)為在正常情況下為維持生理平衡，有骨髓基質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生極少量的G-CSF，誘導(dǎo)粒細(xì)胞的分化和增殖；G-CSF的作用點(diǎn)：G-CSF是通過(guò)靶細(xì)胞膜上的受體實(shí)現(xiàn)作用的，其作用點(diǎn)有兩個(gè)：（1）作用于全向造血干細(xì)胞使之從靜止期進(jìn)入增殖期（G0-G1）；（2）特異性地作用于粒系祖細(xì)胞CFU-G促進(jìn)其增殖分化，同時(shí)作用于整個(gè)粒系：CFU-G （外周血）中性粒細(xì)胞；促進(jìn)增殖分化，功能加強(qiáng)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 480例全血細(xì)胞減少性疾病均為2003年1月-2011年12月筆者所在醫(yī)院血液科門(mén)診及住院的患者，全部為初診患者。根據(jù)患者的臨床表現(xiàn)、血象、骨髓象、細(xì)胞化學(xué)、骨髓細(xì)胞染色體等檢查結(jié)果確定診斷。其中再生障礙性貧血（AA）202例，骨髓增生異常綜合癥（MDS）147例，低增生性白血病85例，巨幼細(xì)胞性貧血21例，多發(fā)性骨髓瘤（MM）10例，惡性組織性疾病9例，骨髓纖維化6例。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集 用肝素抗凝無(wú)菌骨髓3~5 ml。

1.2.2 培養(yǎng)體系的配制 按常規(guī)方法配制骨髓染色體培養(yǎng)液[4]。1號(hào)為瓶1640液8 ml+胎牛血清2 ml，2號(hào)為瓶1640液8 ml+胎牛血清2 ml并加入20 U/ml的GM-CSF，培養(yǎng)體系隨用隨配。

1.2.3 短期培養(yǎng)法 將采集的骨髓注入培養(yǎng)體系中，按（3~8）×106/ml細(xì)胞密度接種到培養(yǎng)體系中，每位患者接種2瓶。1號(hào)瓶為普通的培養(yǎng)體系，2號(hào)瓶為加入了20 U/ml的GM-CSF的培養(yǎng)體系。置37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，終止前2 h加入濃度為5 μg/ml的秋水仙堿0.2 ml，2 h后將骨髓培養(yǎng)液移入10 ml的離心管內(nèi)1000 r/min，離心10 min，棄上清后收獲細(xì)胞。

1.2.4 低滲處理 收獲細(xì)胞后加入預(yù)溫至37 ℃的0.075 mol/L的 KCL 8 ml，輕輕混勻后置37 ℃水浴箱內(nèi)30 min，中間吹打混勻一次。

1.2.5 預(yù)固定與離心 低滲完畢后，直接加入新鮮配制的固定液甲醇：冰醋酸（3：1）1 ml，輕輕打勻，立即離心，1000 r/min、離心10 min。

1.2.6 固定與離心 加固定液8 ml，混勻，室溫靜止10 min，1000 r/min、離心10 min。

1.2.7 二次固定與離心 同（1.2.5），離心完置4 ℃冰箱過(guò)夜，次日滴片。

1.2.8 滴片與烤片 制成細(xì)胞懸液并滴片，滴片后在40烤片機(jī)上烘干，之后放置80 ℃左右的烤片機(jī)上烘烤4 h，室溫放置2 d后做帶。

1.2.9 G顯帶 2.5%胰酶0.5 ml加入到50 ml的Hank’S液中置37 ℃水浴箱中，15 min后作帶，將老化的標(biāo)本在胰酶中作用15~25 s，姬姆薩染色5 min，水洗。

1.3 染色體核心型分析 染色體分析的方法包括鏡下分析、照相分析和電腦分析等三種，以鏡下分析最為常用。按《人類(lèi)細(xì)胞遺傳學(xué)國(guó)際命名體制（ISCN1995）》進(jìn)行染色體核行分析。至少2個(gè)細(xì)胞有同樣的染色體增加或結(jié)構(gòu)重排，或者3個(gè)細(xì)胞有相同的染色體丟失，方可確認(rèn)為一個(gè)異?？寺?。一般情況下分析20~30個(gè)中期細(xì)胞即可，如果發(fā)現(xiàn)一種或數(shù)種異常細(xì)胞，則必須增加分析細(xì)胞數(shù)。

2 結(jié)果

480例全血細(xì)胞減少性疾病采用上述方法制備骨髓細(xì)胞染色體培養(yǎng)，1號(hào)瓶培養(yǎng)結(jié)果439例（91.5%）獲得成功，41例培養(yǎng)失敗。2號(hào)瓶培養(yǎng)結(jié)果480例（100%）全部培養(yǎng)成功。

3 討論

全血細(xì)胞減少性疾病的染色體制備，往往分裂相指數(shù)低，顯帶效果差，難以廣泛開(kāi)展。建立穩(wěn)定的培養(yǎng)、制備、顯帶方法是提高染色體檢查成功率和異常檢出率的關(guān)鍵，加入集落刺激因子可以促進(jìn)骨髓細(xì)胞的分裂增殖，獲得較多的中期分列相，筆者對(duì)加入G-CSF培養(yǎng)體系對(duì)480例全血細(xì)胞減少性疾病的骨髓染色體檢查中，無(wú)一例失敗全部培養(yǎng)成功，較單一采用直接法或短期培養(yǎng)法成功率高。筆者認(rèn)為可以推廣，以提高工作效率，可為細(xì)胞遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)工作參考。

[1] 于華，劉小信，張忠芳.全血細(xì)胞減少性疾病的鑒別診斷[J].齊魯醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)，2005，16（1）：64.

[2] 余潤(rùn)泉.全血細(xì)胞減少癥的鑒別診斷[J].中華內(nèi)科雜志，2004，10（10）：790-792.

[3] 林梓家，閆桂蘭，張金鵬.即刻低滲法在惡性血液病骨髓染色體制備中的應(yīng)用[J].中華醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)雜志，1998，15（5）：325-326.

[4] 薛永權(quán).白血病細(xì)胞遺傳學(xué)及圖譜[M].天津：天津科學(xué)技術(shù)出版社，2003：106.