骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的研究進(jìn)展

閆德祺 閆英選 孫朝陽 宋繼祖 羅金寶

1.甘肅中醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)課部，甘肅蘭州 730000；2.黃淮學(xué)院，河南駐馬店 463000；3.海南醫(yī)學(xué)院，海南?？?571199；4.河南省駐馬店市第一人民醫(yī)院，河南駐馬店 463000；5.甘肅省永靖縣水電四局醫(yī)院，甘肅永靖 731600；6.甘肅省皋蘭縣忠和鎮(zhèn)衛(wèi)生院，甘肅皋蘭 730203

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的研究進(jìn)展

閆德祺1，2閆英選3孫朝陽4宋繼祖5羅金寶6

1.甘肅中醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)課部，甘肅蘭州 730000；2.黃淮學(xué)院，河南駐馬店 463000；3.海南醫(yī)學(xué)院，海南?？?571199；4.河南省駐馬店市第一人民醫(yī)院，河南駐馬店 463000；5.甘肅省永靖縣水電四局醫(yī)院，甘肅永靖 731600；6.甘肅省皋蘭縣忠和鎮(zhèn)衛(wèi)生院，甘肅皋蘭 730203

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）是骨髓基質(zhì)中存在的非造血系的成體干細(xì)胞，具有多向分化潛能，已成為國內(nèi)外基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)研究的熱點。本文簡要介紹了BMSCs的概念提出、生物學(xué)特性、培養(yǎng)、鑒定，并根據(jù)近年來國內(nèi)外包括應(yīng)用中藥進(jìn)行的誘導(dǎo)分化、組織工程、基因治療、再生醫(yī)學(xué)等相關(guān)研究及臨床應(yīng)用前景作一綜述。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；誘導(dǎo)分化；組織工程；中藥

早在1867年，世界著名病理學(xué)家Cohneim發(fā)現(xiàn)了骨髓中非造血系的干細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)這類干細(xì)胞能夠產(chǎn)生愈合傷口的成纖維細(xì)胞，后來Caplan[1]稱之為間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs），因為這類細(xì)胞除骨髓外，還廣泛分布于脂肪、外周血、臍血、羊水、胎盤、胎肺、胎腎、牙髓、肌腱、滑膜、骨骼肌等不同的組織中，可定向分化為造血細(xì)胞以外的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、肌細(xì)胞、腱細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、心肌細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞等多種細(xì)胞，支持造血，對造血干細(xì)胞有擴(kuò)增作用，具有貼壁生長、高度可塑、免疫調(diào)節(jié)的性質(zhì)，在體外易分離和擴(kuò)增，還易于外源基因的轉(zhuǎn)入和表達(dá)[1-2]。本文在此基礎(chǔ)上對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）的研究及其應(yīng)用作一綜述，以期開拓新的研究領(lǐng)域和臨床應(yīng)用。

1 改良性的BMSCs分離培養(yǎng)和鑒定方面的研究

體外培養(yǎng)的小鼠及人的BMSCs形態(tài)學(xué)特征主要表現(xiàn)為梭形、紡錘形，少數(shù)為多角形。BMSCs的體外分離方法有四類：貼壁培養(yǎng)法、密度梯度離心法、流式細(xì)胞術(shù)和免疫磁珠分離法。貼壁培養(yǎng)法更換培養(yǎng)液去除造血系細(xì)胞后還殘留有單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞貼壁生長，需要嚴(yán)格控制胰蛋白酶的劑量和消化時間，連續(xù)培養(yǎng)才能清除并得到相對的純化[3]。其余方法雖然可以獲得純度較高的BMSCs，但易破壞其活性。因此培養(yǎng)鑒定方法的改良引起了研究者的興趣，以期探索獲得高純度BMSCs的簡單、系統(tǒng)的實驗方法。

目前尚未發(fā)現(xiàn)公認(rèn)的BMSCs特異性表面抗原。BMSCs表達(dá) CD34、CD106、CD124、CD105、CD146、CD90、CD13、CD44、CD54、CD29、CD73、CD120a、CD166 等，不表達(dá)造血細(xì)胞的標(biāo)志 CD10、CD11b、CD14、CD31、CD34、CD45、CD49、CD106[4-6]，其中有關(guān)CD34、CD106的報道不一致。通常還是通過形態(tài)和培養(yǎng)特性結(jié)合免疫方法進(jìn)行BMSCs鑒定。

2 BMSCs免疫研究

BMSCs抑制T細(xì)胞增殖導(dǎo)致免疫耐受[7]。把BMSCs與T細(xì)胞共同培養(yǎng)，T細(xì)胞不增殖，且可以對其他異物進(jìn)行反應(yīng)，隨著干細(xì)胞的分化，其抗原性并未隨之增加，說明BMSCs移植潛力很大。Miyake等[3]認(rèn)為BMSCs能夠體外抑制T細(xì)胞功能，指出BMSCs可以作為免疫調(diào)節(jié)劑，控制移植物抗宿主病的發(fā)生，以BMSCs注射受體小鼠骨髓腔，再注射供體細(xì)胞，能夠預(yù)防移植物抗宿主病。

3 誘導(dǎo)分化與相應(yīng)的組織修復(fù)研究

干細(xì)胞在不同的情況下表現(xiàn)出不同的分化方向。BMSCs經(jīng)誘導(dǎo)后可定向分化為樹突狀細(xì)胞、多巴胺能神經(jīng)元、關(guān)節(jié)盤細(xì)胞、心肌細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、肌腱細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞[7-10]，因而可望進(jìn)行相應(yīng)的組織修復(fù)，比如免疫功能的修復(fù)、分泌多巴胺的神經(jīng)細(xì)胞的數(shù)量增加、關(guān)節(jié)盤的修復(fù)、損傷的心肌的修復(fù)、骨骼肌的修復(fù)、軟骨和骨骼的修復(fù)、血管的修復(fù)等。BMSCs的體外分化是組織工程的良好方法。

4 BMSCs標(biāo)記的改良研究

采用BrdU標(biāo)記BMSCs，聯(lián)合BrdU單克隆抗體進(jìn)行免疫組化染色，48 h后細(xì)胞標(biāo)記率＞90%，且不影響細(xì)胞的形態(tài)、生長、增殖及分化。Zhang等[11]認(rèn)為BrdU標(biāo)記是對移植的BMSCs遷移、增值、分化等行為進(jìn)行動態(tài)觀察的切實可行的方法，而且具有無放射性污染、節(jié)約時間、操作方便迅速、標(biāo)記效率高、準(zhǔn)確性高等優(yōu)點。

5 不同方向的動物實驗及臨床應(yīng)用研究

BMSCs可被定向誘導(dǎo)分化為臨床所需的多種組織細(xì)胞，因其取材方便、易于體外培養(yǎng)、擴(kuò)增迅速、較弱的免疫原性，能較好地抑制混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)，不存在組織配型和免疫排斥等方面的問題，符合倫理道德原則，被稱為組織工程及再生醫(yī)學(xué)中理想的種子細(xì)胞[2,4]，可用于不同方向或目的的動物實驗及臨床應(yīng)用研究。Zuo等[12]將關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞與BMSCs共同培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)它們之間存在著相互作用，BMSCs對加強(qiáng)關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)的形成起著刺激和支持作用，直接接觸的效果比可溶性因子的作用更大。Boonyagul等[13]應(yīng)用不同濃度的乙?；事毒厶翘幚泶笫驜MSCs的體外實驗結(jié)果顯示，乙?；事毒厶秋@著增加BMSCs的增殖，血管內(nèi)皮生長因子、骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2、骨涎蛋白和骨橋蛋白的表達(dá)，堿性磷酸酶的活性與骨質(zhì)沉積。在體實驗結(jié)果顯示，乙?；事毒厶侵委熃M與未處理的對照組相比有較高的骨密度，骨愈合快，治療組骨小梁大量生長，表明乙酰化甘露聚糖可通過刺激BMSCs進(jìn)行增殖，誘導(dǎo)骨形成的生物活性分子，使BMSCs分化為成骨細(xì)胞，合成細(xì)胞外基質(zhì)。Xin等[14]將BMSCs與無細(xì)胞生物材料支架結(jié)合成功地重建了組織工程心臟瓣膜，表明種子細(xì)胞與生物支架整合的可行性，且促進(jìn)血液中BMSCs的增值和分化。Matsumoto等[15]應(yīng)用電刺激誘導(dǎo)BMSCs分化成神經(jīng)細(xì)胞，然后移植給腦損傷模型小鼠，發(fā)現(xiàn)電刺激的BMSCs細(xì)胞順利分化成神經(jīng)細(xì)胞，而不是分化成星形膠質(zhì)細(xì)胞，促進(jìn)了腦損傷的恢復(fù)，且發(fā)現(xiàn)電刺激的BMSCs細(xì)胞表達(dá)神經(jīng)元素2增加，通過β-catenin通路抑制BMSCs向星形膠質(zhì)細(xì)胞的分化，促進(jìn)其向神經(jīng)細(xì)胞的分化，表明BMSCs治療腦損傷的前景廣闊。

6 中醫(yī)藥結(jié)合BMSCs的研究

中藥可以通過調(diào)節(jié)微環(huán)境的生長因子水平，促進(jìn)微循環(huán)血供，形成一個有利于移植細(xì)胞存活的微環(huán)境，促進(jìn)干細(xì)胞的定向分化，進(jìn)而應(yīng)用于臨床治療。高志超等[16]應(yīng)用補(bǔ)骨脂素誘導(dǎo)BMSCs，結(jié)果表明，BMSCs復(fù)合載異補(bǔ)骨脂素支架材料具有顯著的骨誘導(dǎo)作用，可應(yīng)用于臨床修復(fù)骨缺損。范東艷等[17]將紅景天苷與BMSCs聯(lián)合應(yīng)用治療帕金森病大鼠，發(fā)現(xiàn)治療后大鼠行為異常程度較輕，腦組織內(nèi)酪氨酸羥化酶mRNA表達(dá)水平較高，表明聯(lián)合用藥優(yōu)于單獨應(yīng)用中藥或BMSCs。程小麗等[18]應(yīng)用補(bǔ)腎益髓中藥血清孵育BMSCs進(jìn)行移植，顯著提高了缺血腦組織中生長因子和神經(jīng)營養(yǎng)因子的水平，較快地恢復(fù)了大腦功能；該研究團(tuán)隊還應(yīng)用地黃飲子孵育BMSCs進(jìn)行移植，能夠顯著提高大鼠缺血損傷腦組織的Bcl-2水平，降低Bax的水平，對缺血性腦損傷具有保護(hù)作用。

7 結(jié)語

BMSCs方面的研究進(jìn)展很快，前進(jìn)中也遇到了如下一些問題：①到目前為止，人們對BMSCs的認(rèn)識仍停留在培養(yǎng)細(xì)胞的特征上，BMSCs的定義仍然是根據(jù)體外培養(yǎng)的細(xì)胞自我更新和分化的潛能而提出的“權(quán)宜性”的概念；人們對活體內(nèi)干細(xì)胞的形態(tài)特征、發(fā)育起源、解剖定位以及在器官生成和出生后組織穩(wěn)態(tài)中所起的作用還知之甚少；目前尚缺乏作為干細(xì)胞所應(yīng)具有的非對稱分裂特征的證據(jù)，未發(fā)現(xiàn)BMSCs特異性的表面標(biāo)志物，難以直接鑒定，還是根據(jù)形態(tài)等非特異性表面標(biāo)志物來判斷，BMSCs的 “干細(xì)胞性”還需要大量的實驗來進(jìn)一步證明。②由于干細(xì)胞的特性、分離方法的限制及BMSCs培養(yǎng)過程中的異質(zhì)性，幾乎不可能得到絕對純化的BMSCs，分離方法的改良研究很多，仍需進(jìn)一步深化。③由于實驗方法、實驗條件的不同，來自不同實驗室的報道不盡一致，甚至有不少矛盾的地方，BMSCs在不同條件下可以治療腫瘤，也可以導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，還需要大量研究來界定條件，排除矛盾。盡管對BMSCs的特性還缺乏認(rèn)識，從研究到應(yīng)用還有個過程，考慮到從1970年起，人們對BMSCs的研究才40余年就取得了豐碩的成果，形成了如下共識，BMSCs具有多向分化潛能和易于體外擴(kuò)增，取材容易，易于基因操作，組織相容性好，是組織工程、基因工程、組織再生修復(fù)的理想種子細(xì)胞，可望廣泛用于腦缺血、心肌缺血等導(dǎo)致的組織損傷的修復(fù)、骨和軟骨組織的修復(fù)、1型糖尿病患者胰島細(xì)胞的分化、血液病和腫瘤疾病的治療、基因治療，中醫(yī)藥的引入拓寬了BMSCs研究的新領(lǐng)域，臨床應(yīng)用前景廣闊。

[1]Caplan AI.Adult mesenchymal stem cells for tissue engineering versus regenerative medicine[J].J Cell Physiol，2007，213（2）：341-347.

[2]Crisan M，Yap S，Casteilla L，et al.A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs[J].Cell Stem Cell，2008，3（3）：301-313.

[3]Miyake T，Inaba M，F(xiàn)ukui J，et al.Prevention of graft-versus-host disease by intrabone marrow injection of donor T cells:involvement of bone marrow stromal cells[J].Clin Exp Immunol，2008，152（1）：153-162.

[4]Tian H，Chen GH，Xu Y，et al.Biological characteristics of bone marrow mesenchymal stem cells and JAK2 mutation in myeloproliferative neoplasms[J].Zhonghua Xue Ye Xue Za Zhi，2012，33（9）：701-704.

[5]Zhu X，Du J，Liu G.The comparison of multilineage differentiation of bone marrow and adipose-derived mesenchymal stem cells[J].Clin Lab，2012，58（9-10）：897-903.

[6]Wang B，Wu SM，Wang T，et al.Pre-treatment with bone marrow-derived mesenchymal stem cells inhibits systemic intravascular coagulation and attenuates organ dysfunction in lipopolysaccharide-induced disseminated intravascular coagulation rat model[J].Chin Med J，2012，125（10）：1753-1759.

[7]Xishan Z，Baoxin H， Xinna Z，et al.Comparison of the effects of human adipose and bone marrow mesenchymal stem cells on T lymphocytes[J].Cell Biol Int，2013，37（1）：11-18.

[8]Chen XZ，Zhang JY，Zeng JY，et al.Differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells into adipocytes and blockage of the differen-tiation[J].Zhonghua Zhong Liu Za Zhi，2012，34（11）：826-830.

[9]Haneef K，Lila N，Benadda S，et al.Development of bioartificial myocardium by electrostimulation of 3D collagen scaffolds seeded with stem cells[J].Heart Int，2012，7（2）：e14.

[10]Hu SJ，F(xiàn)ei Z，Li B，et al.Differentiation of ectomesenchymal stem cells into dendritic cells in vitro induced by cytokines[J].Xi Bao Yu Fen Zi Mian Yi Xue Za Zhi，2012，28（11）：1166-1168.

[11]Zhang MM，Jia GQ，Cheng JQ，et al.In vitro analysis and in vivo tracing of BrdU-labeled rat bone marrow mesenchymal stem cells[J].Sichuan Da Xue Xue Bao Yi Xue Ban，2012，43（2）：266-270.

[12]Zuo Q，Cui W，Liu F，et al.Co-cultivated mesenchymal stem cells support chondrocytic differentiation of articular chondrocytes[J].Int Orthop，2013，37（1）：11-18.

[13]Boonyagul S，Banlunara W，Sangvanich P，et al.Effect of acemannan,an extracted polysaccharide from Aloe vera,on BMSCs proliferation,differentiation,extracellular matrix synthesis,mineralization,and bone formation in a tooth extraction model[J].Odontology，2013，26（1）：35-38.

[14]Xin Y，Wang YM，Zhang H，et al.Research on application of modified polyethylene glycol hydrogels in the construction of tissue engineered heart valve[J].Zhonghua Wai Ke Za Zhi，2008，46（22）：1723-1726.

[15]Matsumoto M，Imura T，F(xiàn)ukazawa T，et al.Electrical stimulation enhances neurogenin2 expression through β-catenin signaling pathway of mouse bone marrow stromal cells and intensifies the effect of cell transplantation on brain injury[J].Neurosci Lett，2013，533：71-76.

[16]高志超，李善昌，金珊丹，等.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合載異補(bǔ)骨脂素支架材料修復(fù)骨缺損的研究[J].口腔醫(yī)學(xué)研究，2012，28（12）：1234-1238.

[17]范東艷，王蘋，陳玉丙.紅景天苷與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)合應(yīng)用對帕金森病大鼠的治療作用[J].吉林大學(xué)學(xué)報（醫(yī)學(xué)版），2012，38（6）：1073-1076.

[18]程小麗，劉永琦，潘政，等.地黃飲子孵育骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對大鼠缺血性腦損傷Bcl-2及Bax表達(dá)的影響[J].中華中醫(yī)藥雜志，2011，26（1）：153-155.

Research progress of bone marrow mesenchymal stem cells

YAN De-qi1,2YAN Ying-xuan3SUN Chao-yang4SONG Ji-zu5LUO Jin-bao6

1.Department of Basic Courses,Traditional Chinese Medicine College in Gansu Province,Lanzhou 730000,China;2.Huanghuai College in Henan Province,Zhumadian 463000,China;3.Hainan Medical University,Haikou 571199,China;4.the First People′s Hospital of Zhumadian City in Henan Province,Zhumadian 463000,China;5.Hydropower Four Hospital of Yongjing County in Gansu Province,Yongjing 731600,China;6.Zhonghe Township Hospital of Gaolan County in Gansu Province,Gaolan 730203,China

Bone marrow mesenchymal stem cells(BMSCs)are non-hemopoietic adult stem cells existed in the bone marrow.BMSCs are multipotent in differentiation which has already been the hot spot in the basic and clinic medicine study both home and abroad.This article briefly overviews the concept,biological characteristics,cultivation,identification of BMSCs,and the recent home and abroad inducement and differentiation,tissue engineering,gene therapy,regeneration medicine study as well as their clinical prospects.

Bone marrow mesenchymal stem cells;Induce and dfferentiation;Tissue engineering;Chinese medicine

R392.12

A

1674-4721（2013）08(c)-0025-03

閆德祺（1967-），男，漢族，甘肅中醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)課部中西醫(yī)結(jié)合2011級碩士研究生，黃淮學(xué)院工程師和醫(yī)生，研究方向為干細(xì)胞和腫瘤

2013-01-24 本文編輯：郭靜娟）