高糖對(duì)人腎小球系膜細(xì)胞增殖及細(xì)胞外基質(zhì)的影響

呂高虹 許惠琴 秦佩佩 劉 斌 劉 凱 (南京中醫(yī)藥大學(xué)教學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，江蘇 南京 210046)

高糖對(duì)人腎小球系膜細(xì)胞增殖及細(xì)胞外基質(zhì)的影響

呂高虹 許惠琴 秦佩佩 劉 斌 劉 凱 (南京中醫(yī)藥大學(xué)教學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，江蘇 南京 210046)

目的觀察不同濃度的葡萄糖對(duì)人腎小球系膜細(xì)胞增殖的影響及對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)纖維連接蛋白(Fn)，Ⅳ型膠原(ColⅣ)的影響。方法體外培養(yǎng)人腎小球系膜細(xì)胞株，分別加入葡萄糖終濃度為5.5、10、20、30、40 mmol/L進(jìn)行處理，于不同時(shí)間段(12、24、48、72 h)用MTT法檢測(cè)腎小球系膜細(xì)胞的增殖情況，ELISA法檢測(cè)培養(yǎng)48 h后條件培養(yǎng)基中Fn及ColⅣ的含量。結(jié)果高糖作用12、24、48、72 h均能促進(jìn)細(xì)胞的增殖，且隨著葡萄糖濃度升高作用時(shí)間的延長(zhǎng)促進(jìn)作用增強(qiáng)。檢測(cè)細(xì)胞上清液的Fn和ColⅣ。與對(duì)照組相比，30 mmol/L D-葡萄糖作用48 h后，F(xiàn)n和ColⅣ表達(dá)增高。結(jié)論高濃度葡萄糖對(duì)系膜細(xì)胞增殖作用具有量效及時(shí)效關(guān)系，我們選擇30 mmol/L濃度的葡萄糖作用48 h為最合適的細(xì)胞刺激條件。高濃度葡萄糖可促進(jìn)系膜細(xì)胞細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生，而系膜細(xì)胞細(xì)胞外基質(zhì)過度表達(dá)，可以直接導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)的積聚，從而導(dǎo)致腎小球硬化的發(fā)生，

人腎小球系膜細(xì)胞;細(xì)胞增殖;纖維連接蛋白;Ⅳ型膠原

糖尿病腎病(DN)是糖尿病最常見而又最難治的微血管并發(fā)癥，其基本病理改變?yōu)榧?xì)胞外基質(zhì)(ECM)積聚和基底膜的增厚〔1〕。腎小球系膜細(xì)胞病變是DN最突出的病理改變之一，它是糖尿病腎病(DN)致病因子作用的主要靶細(xì)胞。高糖能刺激系膜細(xì)胞合成大量的系膜基質(zhì)，導(dǎo)致腎小球硬化，本研究旨在通過利用不同的葡萄糖濃度培養(yǎng)人腎小球系膜細(xì)胞株，探討不同濃度葡萄糖對(duì)人腎小球系膜細(xì)胞增殖及對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)纖維連接蛋白(Fn)，Ⅳ型膠原(ColⅣ)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 人腎小球系膜細(xì)胞 (HRMCs)，購(gòu)自Sciencell，保持了正常人腎小球系膜細(xì)胞基本形態(tài)和生物學(xué)特性。D-葡萄糖購(gòu)自Sigma公司，胰蛋白酶-EDTA消化液購(gòu)自南京凱基生物技術(shù)有限公司，二甲基亞砜 (DMSO)購(gòu)自南京化學(xué)試劑有限公司，胎牛血清為杭州四季青生物工程材料有限公司產(chǎn)品，人纖維連接蛋白Fn、ColⅣELISA試劑盒，購(gòu)自晶美生物公司，MTT細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所。二氧化碳培養(yǎng)箱為日本三洋公司生產(chǎn)，倒置顯微鏡為日本Nikon Ti公司產(chǎn)品，全波長(zhǎng)多功能酶標(biāo)儀由BioTek公司生產(chǎn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 人腎小球系膜細(xì)胞(HRMCs)置于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，于37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)，細(xì)胞經(jīng)0.25%胰酶消化后，用含10%胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)液配制成單個(gè)細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為104～105/ml，接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi)。細(xì)胞貼壁后，血清饑餓24 h，使同步化。在 96孔板中加入終濃度分別為 5.5，10，20，30，40 mmol/L葡萄糖，37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)分別培養(yǎng)12、24、48、72 h，取出后每孔加入5 mg/m l的 MTT 溶液20 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，終止培養(yǎng)后吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，并每孔加入150μl DMSO終止反應(yīng)，微型振蕩器震蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解，立即在酶標(biāo)儀上波長(zhǎng)570 nm處進(jìn)行光密度定量檢測(cè)，以測(cè)得的光密度值(OD)反映細(xì)胞活性和數(shù)量的多少，收集細(xì)胞上清，檢測(cè)細(xì)胞上清中Fn及ColⅣ濃度，檢測(cè)方法參照Fn及ColⅣ試劑盒說明書進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 高糖對(duì)HRMCs的影響 MTT測(cè)定結(jié)果顯示 10、20、30、40 mmol/L葡萄糖培養(yǎng)的HRMCs，隨濃度增加吸收度值增加，表明高濃度葡萄糖能促進(jìn)人腎系膜細(xì)胞的增殖，且培養(yǎng)時(shí)間越長(zhǎng)，促進(jìn)作用越強(qiáng)，但在72 h作用下，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，因此綜合考慮，在48 h、30 mmol/L濃度下刺激作用最強(qiáng)。同劑量甘露醇沒有影響。結(jié)果見表1、表2。

2.2 高糖對(duì)HRMCs Fn、ColⅣ的影響 選擇D-葡萄糖刺激系膜細(xì)胞ECM產(chǎn)生的最佳反應(yīng)時(shí)間點(diǎn)(48 h)觀察高糖條件下對(duì)細(xì)胞上清液Fn、ColⅣ的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示高濃度葡萄糖能刺激Fn、ColⅣ的生成，與對(duì)照組比較有顯著性差異。見表3。

表1 不同濃度葡萄糖體外培養(yǎng)不同時(shí)間對(duì)HMCs增殖的影響(±s，n=5)

表1 不同濃度葡萄糖體外培養(yǎng)不同時(shí)間對(duì)HMCs增殖的影響(±s，n=5)

與5.5 mmol/L組比較:1)P ＜0.05，2)P ＜0.01，下表同

葡萄糖濃度(mmol/L)12 h 24 h 48 h 72 h 5.5 0.264±0.012 0.352±0.025 0.523±0.01 0.857±0.018 10 0.263±0.004 0.352±0.03 0.53±0.038 0.884±0.0281)20 0.265±0.002 0.368±0.017 0.582±0.0252)0.937±0.0522)30 0.265±0.005 0.375±0.0151)0.607±0.0142)1.007±0.0962)40 0.264±0.008 0.359±0.02 0.541±0.01 0.899±0.0261)

表2 不同濃度甘露醇體外培養(yǎng)不同時(shí)間對(duì)HRMCs增殖的影響(±s，n=5)

表2 不同濃度甘露醇體外培養(yǎng)不同時(shí)間對(duì)HRMCs增殖的影響(±s，n=5)

甘露醇濃度(mmol/L)12 h 24 h 48 h 72 h 5.5 0.263±0.01 0.351±0.014 0.527±0.02 0.821±0.04 10 0.263±0.003 0.35±0.009 0.523±0.013 0.829±0.041 20 0.263±0.005 0.35±0.014 0.508±0.024 0.795±0.043 30 0.262±0.008 0.348±0.021 0.508±0.022 0.773±0.019 40 0.266±0.007 0.345±0.013 0.503±0.017 0.755±0.0332)

表3 高糖對(duì)HRMCs中Fn和ColⅣ表達(dá)的影響(±s，n=5)

表3 高糖對(duì)HRMCs中Fn和ColⅣ表達(dá)的影響(±s，n=5)

與5.5 mmol/L組比較:1)P＜0.05

指標(biāo)5.5 10 20 30 Fn 2.447±0.502 3.267±0.362 3.823±0.3311)4.063±0.5061)ColⅣ 11.667±0.340 12.5±0.408 12.833±0.3301)13.8±0.8641)

3 討論

DN的主要病理特點(diǎn)包括腎小球毛細(xì)血管基底膜增厚、系膜外基質(zhì)增多、系膜區(qū)擴(kuò)張及進(jìn)一步發(fā)展形成的彌漫性腎小球硬化與結(jié)節(jié)性腎小球硬化，其中心環(huán)節(jié)是ECM的積聚。高糖是DN發(fā)病最重要的環(huán)境因素。在正常情況下，體外培養(yǎng)的HRMCs增殖能力和分泌ECM的能力很弱，在一定刺激因素的作用下HRMCs的生物學(xué)行為發(fā)生改變〔2〕。在高糖環(huán)境中，尤其是細(xì)胞內(nèi)的高糖可促進(jìn)腎小球系膜細(xì)胞肥大，并使腎臟多種ECM成分如Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅵ型膠原、Fn、LN及蛋白多糖合成增加〔3〕。有研究表明，10 mmol/L以上的高濃度葡萄糖可以促進(jìn)HRMCs的增殖和膠原生成〔4，5〕。

ECM產(chǎn)生是糖尿病腎病發(fā)生的關(guān)鍵〔6〕，ECM是腎小球系膜區(qū)圍繞系膜細(xì)胞的非彌散的固相介質(zhì)，調(diào)節(jié)系膜細(xì)胞增生和分泌各種活性物質(zhì)，其中Fn和ColⅣ是構(gòu)成ECM的重要成分。Fn是一種分布廣泛的ECM糖蛋白，具有介導(dǎo)細(xì)胞黏附和創(chuàng)傷修復(fù)等多種功能，其在ECM中表達(dá)量的增多也是纖維化的重要促進(jìn)因素之一。研究證實(shí)，F(xiàn)n是ECM中變化早而明顯的指標(biāo)之一，作為一種始動(dòng)因素，可以誘導(dǎo)ColⅣ的形成，促進(jìn)腎小球硬化和腎纖維化。ColⅣ是構(gòu)成腎小球基底膜網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的主要膠原成分，正常情況下含量極微，其合成增多及降解減少致ECM積聚，是許多腎臟疾病發(fā)生、終至腎小球硬化的主要原因或重要參與因素之一。ColⅣ和Fn是能較敏感的反應(yīng)基底膜膠原代謝的指標(biāo)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示在一定劑量范圍內(nèi)，葡萄糖可促進(jìn)細(xì)胞的增殖，甘露醇組細(xì)胞未見明顯變化，研究中，觀察到高糖環(huán)境中HRMCs產(chǎn)生 Fn，ColⅣ的含量明顯增加，這與 Nahman 等〔7〕的研究結(jié)果一致，他們同時(shí)證實(shí)了高糖可增加Fn的mRNA水平，高糖環(huán)境刺激體外培養(yǎng)HRMCs合成Fn增加的機(jī)制何在?研究表面，某些細(xì)胞因子可上調(diào)Fn的基因，這些因子包括γ-干擾素，血小板衍化生長(zhǎng)因子，白介素-6，TGF-β等，在高糖環(huán)境中PKC的激活對(duì)HRMCs中Fn的積聚起重要作用〔8〕。系膜細(xì)胞ECM過度表達(dá)，可以直接導(dǎo)致ECM的積聚，從而導(dǎo)致腎小球硬化的發(fā)生，這與其他研究者報(bào)道一致〔9〕。進(jìn)一步證實(shí)了高糖致腎小球硬化作用的分子基礎(chǔ)，這為我們尋找有效的方法在早期即阻斷這一作用提供了思路。

1 呂高虹，許慧琴.腎系膜細(xì)胞與糖尿病腎病變的相關(guān)性研究〔J〕.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2011;13(12):48-9.

2 魏海峰，李 才.單寧酸對(duì)高糖及AGEs引起腎小球系膜細(xì)胞增殖和Ⅳ型膠原生成的影響〔J〕.中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)，2010;14(4):496-8.

3 尹永紅，呂 申.低分子肝素對(duì)腎小球系膜細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)的影響〔J〕.大連醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2010;32(2):166-9.

4 鄧 紅，李海浪.高糖環(huán)境下腎小球細(xì)胞間相互作用對(duì)TGF-β1表達(dá)的影響及茶多酚的干預(yù)作用〔J〕.東南大學(xué)學(xué)報(bào)，2004;23(6):362-6.

5 張 艷，關(guān)廣聚，陳 兵，等.酶酚酸酯對(duì)高糖所致大鼠腎小球系膜細(xì)胞增殖的影響〔J〕.山東大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2006;44(7):718.

6 Rossert J，Terraz-Durasnel C，Bridean G.Growth factors，cytokines，and renal fibrosis during the course of diabetic nephropathy〔J〕.Diabetes Metab，2000;26(4):16-24.

7 Nahman NS，Loohar T，Cosio FG，etal.Effects of high glucose on cellular proliferation and fibronectin by cultured human mesangial cells〔J〕.Kidney Int，1992;41:396.

8 邱紅渝，屈燧林.高糖濃度對(duì)人腎小球系膜細(xì)胞的作用〔J〕.重慶醫(yī)學(xué)，1999;11(28):412-3.

9 Liu W，Liu P，Tao S，et al.Berberine inhibits aldose reductase and oxidative stress in ratmesangial cells cultured under high glucose〔J〕.Arch Biochem Biophys，2008;475(2):128-34.

Effects of high glucose on proliferation of human mesangial cells and extracellular matrix

Lü Gao-Hong，XU Hui-Qin，QIN Pei-Pei，et al.
Research Center of Nanjing University of Traditional Chinese M edicine，Nanjing 210046，Jiangsu，China

ObjectiveTo observe the effects of glucosewith different concentrations on humanmesangial cells(HRMCs)fibroneetin(Fn)and type collagenⅣ (ColⅣ).MethodsIn vitro HRMCswere put into different glucose concentrations respectively(5.5，10，20，30 and 40mmol/L)and processed in order to detect the proliferation of HRMCswith MTTmethod atdifferent times(12，24，48，72 h)and the contents of Fn and ColⅣ with ELISAmethod in 48 hours.ResultsHigh glucose could promote cell proliferation after12，24，48，72 h，and it became stronger as glucose concentration increasing and the time lasting longer.Compared with the control group，30 mmol/L D-glucose after 24 h，the expression of Fn and ColⅣ were increased.ConclusionsHigh glucose has a dose and time effecton the proliferation of HRMCs，glucose with 30 mmol/L and 48 h is the most appropriate conditions for cellular stimulation.High glucose can promote HRMCs to produce ECM，mesangial cell ECM over expression can directly lead to the accumulation of ECM，and the occurrence of glomerular sclerosis.

Human mesangial cells;Cell proliferation;Fibroneetin;Collagen Ⅳ

R39

A

1005-9202(2013)05-1066-02;

10.3969/j.issn.1005-9202.2013.05.037

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81073111)

許惠琴(1961-)，女，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事內(nèi)分泌藥理研究。

呂高虹(1976-)，女，實(shí)驗(yàn)師，碩士在讀，主要從事內(nèi)分泌藥理研究。

〔2012-03-16收稿 2012-09-16修回〕

(編輯 曹夢(mèng)園)