DNA生物傳感器快速檢測(cè)病原微生物的臨床實(shí)驗(yàn)研究

張?jiān)r亮 任玉琰

DNA生物傳感器快速檢測(cè)病原微生物的臨床實(shí)驗(yàn)研究

張?jiān)r亮 任玉琰

目的 對(duì)DNA生物傳感器在病原微生物的快速檢測(cè)方面的臨床實(shí)驗(yàn)效果進(jìn)行分析探討。方法 采用SPR傳感器對(duì)甲型流感病毒進(jìn)行微生物快速檢測(cè)。結(jié)果 SPR傳感器在與流感病毒的核酸進(jìn)行雜交后, 能夠靈敏、準(zhǔn)確地將病毒的折射率反映出來, 且效率和敏感性都比較高。結(jié)論 DNA生物傳感器相較于傳統(tǒng)檢測(cè)方法更具優(yōu)勢(shì), 具有高通量、高敏感、高效率以及低成本等優(yōu)點(diǎn), 值得推廣應(yīng)用

DNA生物傳感器；快速檢測(cè)；病原微生物

分子生物檢測(cè)法相較于傳統(tǒng)的微生物檢測(cè)方法,具有快速、敏感、成本低以及通量高等優(yōu)點(diǎn)［1］, 因而在病原檢測(cè)中得到了廣泛應(yīng)用, DNA生物傳感器主要是通過探針將病原微生物中的DNA信息進(jìn)行捕獲后, 由換能器轉(zhuǎn)換成信號(hào)來實(shí)現(xiàn)檢測(cè)目的的一種親和型傳感器。本文主要對(duì)DNA生物傳感器在病原微生物檢測(cè)中的應(yīng)用效果進(jìn)行分析, 現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇甲型流感病毒作為檢測(cè)對(duì)象,由本地的疾病控制預(yù)防中心提供。本次研究所使用的儀器主要有表面等離子體共振成像系統(tǒng), GDS8000圖像分析儀, 恒溫水浴箱和干燥箱, 冷凍和微量離心機(jī), PCR儀以及芯片雜交盒等；實(shí)驗(yàn)中所使用的試劑主要有金膜, 寡核苷酸引物, 6-巰基乙醇, bis-PNA探針, 病毒RNA抽提盒以及PCR試劑等。

1.2 試驗(yàn)方法 ①配制試劑, 對(duì)Piranha試劑、Tris-HCL緩沖液以及磷酸鹽緩沖液等進(jìn)行配制；②確定靶核酸, 在本次研究中將流感病毒的M基因片段選作靶核酸進(jìn)行檢測(cè)；③對(duì)探針和引物進(jìn)行設(shè)計(jì)；④提取流感病毒核酸, 將140 μl病毒培養(yǎng)液加入到560 μl的AVL緩沖液中, 在孵育10 min之后加入560 μl乙醇進(jìn)行攪拌。然后將混合液加入到離心機(jī)中進(jìn)行離心處理, 反復(fù)兩次后, 分別加入AW1和AW2緩沖液進(jìn)行離心處理, 然后加入40 μl的AVE緩沖液進(jìn)行離心處理, 這樣收集到的濾液就是流感病毒的核酸溶液；⑤將流感病毒的核酸逆轉(zhuǎn)錄為cDNA, 并對(duì)其進(jìn)行PCR擴(kuò)增處理；⑥對(duì)探針進(jìn)行還原和自組裝處理；⑦雜交反應(yīng), 將病毒待檢的雙鏈DNA加入到磷酸鹽緩沖液中, 然后將其滴加到金膜探針區(qū), 放入雜交盒中進(jìn)行雜交反應(yīng), 保持雜交盒的溫度為37℃左右。

1.3 SPR檢測(cè) ①將雜交反應(yīng)后的玻片取出沖洗干凈后, 用SPR傳感器對(duì)其SPR信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)；②改變探針濃度, 并按照上面的方法進(jìn)行固定后, 再次對(duì)病毒DNA的SPR信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)；③繼續(xù)按照上面的步驟改變探針濃度, 在完成探針固定后, 對(duì)與靶核酸雜交后的SPR信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)；④對(duì)敏感性進(jìn)行檢測(cè), 在待測(cè)芯片的表面用雜交圍欄進(jìn)行分割, 并取5 μmol/L濃度的探針進(jìn)行點(diǎn)樣固定, 在封閉金膜后, 對(duì)各個(gè)雜交區(qū)內(nèi)的SPR信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)；取雜交液與純化核酸進(jìn)行混合, 然后制成不同濃度與探針進(jìn)行雜交, 對(duì)不同濃度的雜交金膜進(jìn)行SPR信號(hào)檢測(cè), 并將其與單純雜交液的結(jié)果進(jìn)行對(duì)比。

2 結(jié)果

檢測(cè)流感病毒的M基因片段擴(kuò)增引物的片段大小是117 bp, 并對(duì)其進(jìn)行檢測(cè), 結(jié)果顯示這一大小符合檢測(cè)設(shè)計(jì)要求, 特異性優(yōu)良；改變探針濃度后, SPR信號(hào)的折射率會(huì)隨著濃度的增加而增加, 在濃度超過5 μmol/L后增加幅度趨緩；改變探針濃度后,雜交物的SPR信號(hào)折射率也隨著濃度的增加而增加,在超過5 μmol/L后折射率隨著濃度增加而降低；在敏感性試驗(yàn)上, 1 pmol/L濃度以下的雜交液其SPR信號(hào)的折射率與純雜交液的折射率之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義, 差異較小。而在超過1 pmol/L濃度之后, 雜交液的折射率隨著濃度的增加而增加, 且與純雜交液之間的折射率差異也越來越大, 在5 pmol/L濃度之后差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義, P<0.05。

3 討論

DNA生物傳感器是由探針和換能器兩部分組成, 根據(jù)換能器信號(hào)轉(zhuǎn)換的不同, 可將其分為光學(xué)傳感器、壓電傳感器以及電化學(xué)傳感器三種, 而根據(jù)標(biāo)記物的選用與否又可以將其分為非標(biāo)記型和標(biāo)記型。標(biāo)記型主要是通過信號(hào)分子對(duì)待測(cè)物的核酸進(jìn)行標(biāo)記, 然后與探針進(jìn)行雜交使標(biāo)記物被固定在傳感器表面上, 這樣通過檢測(cè)信號(hào)分子的信號(hào)變化就能反映出待測(cè)物的信息。而非標(biāo)記型則是將標(biāo)記這一步驟省略, 直接用傳感器對(duì)待測(cè)物進(jìn)行檢測(cè), 通過其所引起的電化學(xué)或質(zhì)量改變來反映待測(cè)物信息［2］。在本次研究中, 筆者主要選用了非標(biāo)記型傳感器中的典型代表SPR傳感器, 對(duì)其在病原微生物檢測(cè)中的應(yīng)用進(jìn)行了分析, 非標(biāo)記型傳感器的優(yōu)點(diǎn)就在于其省略了用信號(hào)分子標(biāo)記待測(cè)物這一步, 節(jié)省了繁瑣的標(biāo)記過程, 同時(shí)也避免了信號(hào)探針或分子對(duì)待測(cè)物與傳感器之間雜交的影響, 節(jié)約了標(biāo)記材料的費(fèi)用, 縮短了檢測(cè)時(shí)間, 提高了微生物檢測(cè)效率［3］。

SPR對(duì)于折射率的變化非常靈敏, 通過成像技術(shù), SPR傳感器能夠?qū)⑽⑸镄酒恼凵渎首兓尸F(xiàn)出來, 從而實(shí)現(xiàn)對(duì)微生物進(jìn)行檢測(cè)的目的。在本次研究中, 作者主要對(duì)甲型流感病毒的折射率分布進(jìn)行了檢測(cè), 結(jié)果顯示, SPS傳感器能夠靈敏地將病毒的M基因片段折射率在成像系統(tǒng)上的分布顯示出來, 且分辨率較高, 能夠得到檢測(cè)物折射率與灰度值之間對(duì)應(yīng)二維圖像, 此方法的通量高、敏感性好, 測(cè)量范圍廣。在本次研究中, 實(shí)驗(yàn)室選用的探針為bis-PNA, 并對(duì)其進(jìn)行了巰基修飾處理, 這樣與金膜所組成的敏感膜對(duì)M基因片段擴(kuò)增物進(jìn)行檢測(cè), 而檢測(cè)結(jié)果顯示, 此探針能夠與雙鏈DNA進(jìn)行直接結(jié)合,然后直接進(jìn)行SPR檢測(cè)能夠?qū)⒔鹉さ恼凵渎市畔⒖焖俚胤从吵鰜? 這說明這種探針設(shè)計(jì)在甲型流感病毒的檢測(cè)中是可行的。同時(shí), 在本次研究中, 筆者還對(duì)不同濃度探針下折射率的變化進(jìn)行了分析, 結(jié)果表明, 隨著濃度的增加, 金膜的折射率也隨之增加,但在超過5 μmol/L濃度后, 這種增加趨勢(shì)變緩, 這說明在5 μmol/L濃度以下的探針其對(duì)金膜折射率的反映更為敏感。同時(shí), 筆者還對(duì)不同濃度探針下雜交后的金膜折射率進(jìn)行了分析, 結(jié)果表明, 在5 μmol/L濃度之下, 隨著濃度的增加, 金膜折射率也隨之增加,且增加幅度較大。在超過5 μmol/L濃度探針之后,金膜的折射率隨著濃度增加反而下降, 這說明在5 μmol/L濃度之下的探針對(duì)雜交后的金膜折射率更為敏感, 而在超過5 μmol/L之后, 其敏感性會(huì)下降。另外, 本次研究還對(duì)SPR在流感病毒檢測(cè)上的敏感性進(jìn)行了研究, 主要對(duì)不同濃度的靶序列在SPR檢測(cè)上的敏感性進(jìn)行了比較分析, 結(jié)果顯示, 在1 pmol/L濃度之下, 靶序列折射率與純雜交液的折射率之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義, 而在超過1 pmol/L之后, 靶序列折射率隨著濃度的增加而增加, 且在5 pmol/L濃度之后差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義, P<0.05, 這說明本次檢測(cè)的靈敏度為1 pmol/L。但本次由于時(shí)間原因, 僅僅對(duì)SPR傳感器在流感病毒檢測(cè)方面的應(yīng)用進(jìn)行了驗(yàn)證, 還需要對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步的臨床應(yīng)用和方法學(xué)評(píng)價(jià), 且從本次研究的結(jié)果來看, SPR傳感器檢測(cè)在系統(tǒng)穩(wěn)定性、檢測(cè)方法以及檢測(cè)探針等方面還有待改進(jìn)提高。

綜上所述, SPR傳感器作為DNA傳感器的一種,能夠快速、靈敏地將待測(cè)物折射率分布情況進(jìn)行反映, 且通量高、成像質(zhì)量好, 值得在臨床推廣。這也說明DNA生物傳感器與傳統(tǒng)檢測(cè)方法相比, 具有高通量、高效率等優(yōu)點(diǎn), 是未來病原微生物檢測(cè)的主要檢測(cè)手段, 因此研究人員應(yīng)該加強(qiáng)對(duì)DNA傳感器的研究, 發(fā)展傳感器技術(shù), 以不斷提高微生物檢測(cè)的效率和質(zhì)量。

［1］蔡怡珊.基于電化學(xué)交流阻抗技術(shù)的DNA生物傳感器對(duì)軍團(tuán)菌基因檢測(cè).理化檢驗(yàn)(化學(xué)分冊(cè)), 2012, 48(9):1090-1093.

［2］滕瑛巧.基于磁性高分子微球電化學(xué)DNA生物傳感器用于水體中大腸桿菌的檢測(cè).分析化學(xué), 2009, 37(02): 60-60.

［3］王云霞.電化學(xué)生物傳感器在病原微生物快速檢測(cè)中的研究進(jìn)展.中華醫(yī)院感染學(xué)雜志, 2012, 22(16):3677.

Experimental studtes on DNA biosensors for rapid detection of pathogenic microorganism

ZHANG Yi-liang, REN Yu-yan. Yantaishan Hospital, Yantai 264001, China

Objective To evaluate the clinical effect of DNA biosensor for rapid detection of pathogenic microorganisms.Methods Using the SPR sensor for rapid detection of microorganisms on influenza a virus.Results SPR sensor in nucleic acid hybridization with influenza virus, the virus can sensitively, accurately reflected the refractive index, and the efficiency and sensitivity were high.Conclusion The traditional method of detecting DNA biosensor compared with more advantages, the advantages of high throughput, high sensitive, high efficiency and low cost, and is worthy of popularization and application.

DNA biosensor; Rapid detection; Pathogenic microorganisms

R446

A

1674-9308(2013)03-0005-02

10.3969/J.ISSN.1674-9308.2013.03.003

264001 山東省煙臺(tái)市煙臺(tái)山醫(yī)院