銀杏葉提取物對氧糖剝奪誘導(dǎo)的體外培養(yǎng)大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷的影響*

牟芳芳 于永娟 張澤安 陸萍萍 邵水金

（上海中醫(yī)藥大學(xué)，上海 201203）

銀杏葉提取物（EGb761）含有多種活性成分，具有清除自由基和過氧化脂質(zhì)、擴(kuò)張血管、改善循環(huán)、抗動脈粥樣硬化以及神經(jīng)保護(hù)等作用，廣泛應(yīng)用于治療心腦血管系統(tǒng)疾病，對腦缺血缺氧損傷有保護(hù)作用［1-2］，但機(jī)理尚不完全清楚。星形膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)主要組成細(xì)胞，負(fù)擔(dān)了主要的細(xì)胞間物質(zhì)和信號交流功能［3-4］。本研究采用體外原代培養(yǎng)的大鼠皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞，通過氧糖剝奪再復(fù)氧建立細(xì)胞損傷的模型，探討EGb761對抗缺氧再復(fù)氧誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷作用的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 金納多注射液（17.5 mg/5 mL），臺灣濟(jì)生化學(xué)制藥廠股份有限公司，DMEM、無糖DMEM、0.25%胰蛋白、D-Hanks液等購于Gibco公司，胎牛血清（Hy-Clone），多聚賴氨酸（Sigma），連二亞硫酸鈉（Na2S2O4）購于上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）試劑盒，購于南京建成生物工程研究所，Bradford試劑盒、Western blot配膠試劑盒、PVDF 膜、WST-1、bcl-2、bax、caspase-3 抗體、二抗及ECL顯色試劑盒等皆購于碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2方 法

1.2.1 星形膠質(zhì)細(xì)胞原代培養(yǎng) 將出生24 h內(nèi)的SD乳鼠處死后置75%酒精中浸泡5 min，取出帶入無菌室，用消毒的手術(shù)器械取出腦組織，置于裝有預(yù)冷DHanks液的無菌玻璃皿中，清洗3次，在解剖鏡下用顯微鑷剝離腦膜，取出皮質(zhì)，置于裝有D-Hanks液的無菌小瓶中剪碎，棄去D-Hanks液，再用D-Hanks液輕柔吹打組織塊2次后，將組織碎塊轉(zhuǎn)入0.25%的胰蛋白酶液的離心管內(nèi)，放入37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中30min，其間震蕩1～2次。加入完全培養(yǎng)基 （20%FBS＋DMEM高糖＋100 U雙抗）以終止消化，靜置2 min后，用吸管吹打數(shù)次，形成初細(xì)胞懸液。經(jīng)200目篩網(wǎng)過濾后加入培養(yǎng)瓶。置于培養(yǎng)箱30 min后，倒轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，吸出液體，利用差速黏附法去除成纖維細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)后，以1×106/mL的密度種入事先包被多聚賴氨酸的培養(yǎng)瓶中，置 37℃的 5%CO2培養(yǎng)箱中，2～3 d換液 1次，培養(yǎng)7～9 d后傳代使用。細(xì)胞進(jìn)行GFAP免疫熒光+Hoechst 33258復(fù)染法鑒定，第3代星形膠質(zhì)細(xì)胞純度>95%。

1.2.2 氧糖剝奪/復(fù)氧 （oxygen-glucose deprivation/reoxygenation，OGD/R）模型建立及實(shí)驗(yàn)分組［5-6］在細(xì)胞約80%融合時(shí)，進(jìn)行OGD/R實(shí)驗(yàn)。取棄去原培養(yǎng)液，用無糖DMEM輕洗1遍，加入終濃度為10 mmol/L的Na2S2O4無糖DMEM液，置于37℃，5%CO2孵箱中孵育90 min［以上為氧糖剝奪（OGD）］。取出培養(yǎng)板，棄去原液，加入正常培養(yǎng)液，放入37°C，5%CO2孵箱中孵育24 h［以上為復(fù)氧處理（R）］。實(shí)驗(yàn)分為3組。正常對照組：不經(jīng)OGD/R，始終給予正常培養(yǎng)液。模型組：OGD 90 min，復(fù)氧24 h處理。EGb761組：EGb761終質(zhì)量濃度分別為 25、50、100 μg/mL，于 OGD 前 1 h 加入，直至OGD/R實(shí)驗(yàn)結(jié)束。

1.2.3 細(xì)胞活力測定（WST-1法） 按WST-1細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測試劑盒說明書進(jìn)行操作，96孔板每孔加入100 μL細(xì)胞懸液，使細(xì)胞數(shù)量為每孔6000個，培養(yǎng)24 h。各實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行OGD 90 min，復(fù)氧24 h后，每孔加入WST-1溶液10 μL。以加入相應(yīng)量細(xì)胞培養(yǎng)液和WST-1溶液但沒有加入細(xì)胞的孔作為空白對照，每組5復(fù)孔，培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育2 h。孵育結(jié)束后在全自動酶標(biāo)儀上測定450 nm處的光密度值（OD），參考波長為620 nm。

1.2.4 培養(yǎng)液中LDH測定 乳酸脫氫酶 （lactate dehydrogenase，LDH）是一種廣泛存在于所有細(xì)胞胞漿中的酶，此酶可因細(xì)胞受損后細(xì)胞膜通透性改變而大量滲漏至胞外，通過測定培養(yǎng)液中該酶的活力可間接判斷細(xì)胞的受損程度。OGD結(jié)束后，不經(jīng)再給氧處理，從培養(yǎng)板各孔取上清，按乳酸脫氫酶測定試劑盒說明書操作，在酶標(biāo)儀450 nm波長下讀取各孔OD值，計(jì)算各樣本的平均值。LDH含量以U/L表示。

1.2.5 Hoechst 33258染色96孔板內(nèi)，每孔加入6×104/mL細(xì)胞懸液100μL培養(yǎng)24h。各實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行OGD 90 min，復(fù)氧24 h后，吸盡培養(yǎng)液，每孔加入100 μL固定液，固定20 min，棄去固定液，0.01 mol/L的PBS洗兩遍，每次2 min，吸盡液體。加入100 μL Hoechst 33258染色液，染色5min。棄去染色液，PBS洗兩遍，每次2 min。直接在熒光顯微鏡檢測，可見被染成藍(lán)色的細(xì)胞核，其中活細(xì)胞核呈彌散均勻藍(lán)色熒光，出現(xiàn)細(xì)胞凋亡時(shí)，染色質(zhì)固縮，細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見濃染致密的顆粒塊狀熒光。

1.2.6 細(xì)胞免疫熒光染色 將經(jīng)過OGD/R以及EGb761孵育后的各組細(xì)胞，用4%多聚甲醛固定20min，PBS浸洗細(xì)胞3次，每次2 min，加入1%的BSA，37℃條件下孵育30min后，室溫放置1 h，棄去BSA，加入GFAP 抗體（1∶100），對照組加入等量 PBS，4 ℃過夜。然后37℃條件下孵育2 h，PBS浸洗細(xì)胞3次，每次2 min，加入二抗，37℃條件下孵育1 h。經(jīng)Hoechst 33258染核5 min后，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞。

1.2.7 Western blot檢測 blc-2、bax、caspase-3 蛋白表達(dá)變化 經(jīng)過OGD/R以及EGb761孵育后的六孔板上的各組細(xì)胞，每孔加入裂解液100 μL，經(jīng)裂解、破碎、離心后，用Bradford法進(jìn)行蛋白定量，調(diào)整各樣品蛋白終濃度為 2 μg/μL。 取 20 μL 樣品進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜、5%脫脂奶粉室溫封閉1 h后，滴加相應(yīng)的一抗，4 ℃冰箱過夜：blc-2 （1∶1000）、bax （1∶500）、caspase-3（1∶500）、β-actin（1∶1000）。滴加相應(yīng)二抗（1∶1000），室溫孵育 2 h，PBS 清洗，加入 ECL，反應(yīng) 1～5 min，使用Tanon 4500SF全自動數(shù)碼凝膠化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)和GIS 1D分析軟件檢測蛋白表達(dá)，與內(nèi)參相比，進(jìn)行組間統(tǒng)計(jì)分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。各組數(shù)據(jù)以表示。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 不同質(zhì)量濃度EGb761對OGD/R誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞活力及LDH釋放量的影響 生長狀態(tài)良好的星形膠質(zhì)細(xì)胞經(jīng)過不同質(zhì)量濃度EGb761孵育24 h后，WST-1測定細(xì)胞活性。結(jié)果顯示（見圖1）：當(dāng)EGb761質(zhì)量濃度低于50 μg/mL時(shí)，藥物對細(xì)胞沒有毒性作用，且對細(xì)胞具有一定的刺激增殖作用。當(dāng)藥物質(zhì)量濃度大于100 μg/mL后，細(xì)胞活力隨藥物質(zhì)量濃度的增高而逐漸降低。星形膠質(zhì)細(xì)胞與EGb761共培養(yǎng)24 h后，進(jìn)行OGD處理。LDH活性檢測結(jié)果顯示（見圖2）：星形膠質(zhì)細(xì)胞經(jīng)OGD處理后LDH的釋放與對照組比較明顯升高（P＜0.01），與 EGb761（25、50、100 μg/mL）共培養(yǎng)24 h，能使LDH的釋放量降低，與OGD組相比差異明顯（P ＜0.01），而高質(zhì)量濃度組（100 μg/mL）與低質(zhì)量濃度組（25、50 μg/mL）相比，其 LDH 釋放量又有增高的趨勢。其結(jié)果提示：EGb761在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)能減輕OGD誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷。

圖1 不同質(zhì)量濃度EGb761孵育24 h對大鼠皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞活力的影響

圖2 EGb761對星形膠質(zhì)細(xì)胞OGD損傷LDH釋放量的影響

為了觀察EGb761與OGD/R（90 min/24 h）損傷對星形膠質(zhì)細(xì)胞活性的影響，筆者用WST-1法進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示（見圖3）：相較于正常對照組，經(jīng)OGD/R處理后的皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞的OD值明顯降低 （P＜0.01）。 而 EGb761 組（25、50 μg/mL） OD 值顯著升高（P＜0.01），且高低劑量組間相比差異明顯（P＜0.05）。其結(jié)果表示，EGb761能夠減輕OGD/R導(dǎo)致的細(xì)胞損傷，提高細(xì)胞活性。

圖3 EGb761對星形膠質(zhì)細(xì)胞OGD/R損傷后細(xì)胞活性的影響

2.2 EGb761對星形膠質(zhì)細(xì)胞OGD/R損傷后細(xì)胞形態(tài)的影響 （免疫熒光染色） GFAP（Glial Fibrillary Acidic Protein）是一種星形膠質(zhì)細(xì)胞特異性的中間纖維蛋白，是星形膠質(zhì)細(xì)胞的骨架蛋白。GFAP染色后，在熒光顯微鏡下觀察（見圖4）：模型組星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量明顯減少，細(xì)胞突起收縮、變少，相互之間的交聯(lián)減少；EGb761組與模型組相比細(xì)胞數(shù)量增多，與正常對照組相比細(xì)胞形態(tài)變化較少，仍有較多突起，相互交聯(lián)。這表明，EGb761在形態(tài)上對星形膠質(zhì)細(xì)胞具有保護(hù)作用。

圖4 EGb761對星形膠質(zhì)細(xì)胞OGD/R損傷后形態(tài)變化

2.3 EGb761對OGD/R誘導(dǎo)大鼠皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡的影響 各組細(xì)胞進(jìn)行Hoechst 33258染色。熒光顯微鏡下可見正常細(xì)胞核呈彌散均勻藍(lán)色熒光，出現(xiàn)細(xì)胞凋亡時(shí)，染色質(zhì)固縮，細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見濃染致密的顆粒塊狀熒光。模型組凋亡星形膠質(zhì)細(xì)胞所占百分比明顯增高，與正常對照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；EGb761干預(yù)后凋亡細(xì)胞明顯減少（P＜0.01）；且高低劑量組之間亦有明顯差異（P＜0.01）（見圖 5）。

2.4 EGb761對OGD/R誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷bcl-2、bax、caspase-3表達(dá)的影響 各組細(xì)胞用Westernblot法檢測 bcl-2、bax、caspase-3蛋白。 細(xì)胞經(jīng) OGD/R損傷后，促凋亡基因bax蛋白表達(dá)增高，而EGb761能下調(diào)bax蛋白表達(dá)。相對bax表達(dá)變化，bcl-2變化較不明顯（圖6A）。一般認(rèn)為bcl-2與bax形成異源二聚體調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡，而bcl-2/bax比值對決定細(xì)胞命運(yùn)起關(guān)鍵作用，從圖6B來看，OGD/R損傷使bcl-2/bax比值顯著降低（P＜0.01），而給予EGb761發(fā)現(xiàn)bcl-2/bax比值明顯升高（P＜0.01）。

同時(shí)，caspase-3作為凋亡程序啟動的重要蛋白分子，如圖6C所示，OGD/R誘導(dǎo)可使caspase-3激活，表達(dá)量比正常對照組增加約2.5倍 （P＜0.01），而給予EGb761則明顯抑制了OGD/R導(dǎo)致的細(xì)胞caspase-3激活，與OGD/R相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。由此推測EGb761對大鼠皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞的保護(hù)作用可能通過調(diào)整bcl-2、bax蛋白表達(dá)，增加bcl-2/bax比值，抑制caspase-3激活，從而抑制細(xì)胞凋亡。

圖5 EGb761對OGD/R誘導(dǎo)大鼠皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡的影響

圖6 EGb761對星形膠質(zhì)細(xì)胞OGD/R損傷后bcl-2、bax、caspase-3表達(dá)變化的影響

3 討 論

多數(shù)缺血性腦血管病變的主要病理過程為腦缺血再灌注，在缺血中心區(qū)以細(xì)胞壞死為主，而在缺血邊緣區(qū)（半暗帶）尚存部分葡萄糖和氧，以細(xì)胞凋亡為主，半暗帶發(fā)展趨勢可能最終影響腦梗死體積［7］。研究證實(shí)EGb761能通過抑制炎癥反應(yīng)、清除氧自由基、抑制性氨基酸之間的動態(tài)平衡、抑制細(xì)胞凋亡等途徑保護(hù)腦血管、減輕缺血性腦損傷［8］。在筆者前期試驗(yàn)中也已證實(shí)EGb761給藥能減輕大腦中動脈缺血再灌注（MCAO）大鼠行為障礙，明顯減少腦梗死體積，抑制MCAO大鼠海馬caspase-3的表達(dá)，而TUNEL檢測也表明，在缺血半暗帶區(qū)凋亡的神經(jīng)細(xì)胞數(shù)顯著下降，證明了EGb76l通過抑制細(xì)胞的凋亡而發(fā)揮其神經(jīng)保護(hù)作用［4］。

星形膠質(zhì)細(xì)胞是哺乳動物腦內(nèi)分布最廣泛的一類細(xì)胞，其量遠(yuǎn)超過神經(jīng)元，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中神經(jīng)元不可能離開星形膠質(zhì)細(xì)胞而存在，因此不能脫離星形膠質(zhì)細(xì)胞研究神經(jīng)損傷的機(jī)制。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)星形膠質(zhì)細(xì)胞在腦損傷后的信號傳遞等十分重要的作用，其凋亡可以促成神經(jīng)元的繼發(fā)性死亡，從而導(dǎo)致梗死區(qū)的進(jìn)一步擴(kuò)大［9-10］。因此有效預(yù)防腦缺血后星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡的發(fā)生，將很大程度上起到直接和間接的腦保護(hù)作用。

在以往的實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)EGb761能抑制MCAO大鼠腦皮質(zhì)Cx43的磷酸化［4］，而星形膠質(zhì)細(xì)胞上存在大量Cx43［11］。為了探討EGb761的神經(jīng)保護(hù)作用是否與星形膠質(zhì)細(xì)胞有直接關(guān)系，筆者利用體外培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞OGD/R損傷模型模擬機(jī)體缺血/再灌注損傷。本實(shí)驗(yàn)中，星形膠質(zhì)細(xì)胞在OGD/R后，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯改變，出現(xiàn)胞體脫落，突起減少、斷裂，相互間交聯(lián)減少，大量細(xì)胞崩解死亡。LDH漏出明顯增加，細(xì)胞活性降低，也印證了星形膠質(zhì)細(xì)胞嚴(yán)重?fù)p傷。EGb761能在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)刺激細(xì)胞增殖，并使OGD導(dǎo)致的LDH漏出減少，細(xì)胞活性增高，減輕細(xì)胞損傷，從細(xì)胞形態(tài)觀察上也證實(shí)了這一點(diǎn)。同時(shí)，Hoechst 33258染色觀察到OGD/R損傷可導(dǎo)致星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡增多，而EGb761則能夠減少OGD/R誘導(dǎo)的凋亡。

細(xì)胞凋亡與許多疾病的發(fā)生密切相關(guān)，bcl-2基因家族在細(xì)胞凋亡調(diào)控中具有重要作用，其家族主要包括抑制凋亡基因，如bcl-2和促進(jìn)凋亡基因，如bax等。一般認(rèn)為bcl-2與bax形成異源二聚體調(diào)節(jié)線粒體結(jié)構(gòu)與功能的穩(wěn)定性，調(diào)控線粒體促凋亡因子（如Cytc）的釋放，從而構(gòu)成重要的細(xì)胞凋亡調(diào)控點(diǎn)之一［12-13］。bcl-2/bax的相對比例決定了細(xì)胞在接受凋亡信號后是否發(fā)生凋亡［14］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示細(xì)胞經(jīng)OGD/R損傷后，促凋亡基因bax蛋白表達(dá)增高，EGb761能下調(diào)bax蛋白表達(dá)。相對bax表達(dá)變化，bcl-2變化較不明顯，但bcl-2/bax比值變化明顯。OGD/R損傷可使bcl-2/bax比值明顯增高，給予EGb761則明顯逆轉(zhuǎn)這種趨勢。因此，推測EGb761抑制OGD/R誘導(dǎo)凋亡的機(jī)制可能與調(diào)節(jié)bcl-2、bax蛋白表達(dá)，調(diào)整bcl-2/bax之間的平衡有密切關(guān)系。

細(xì)胞凋亡雖然受高度程序化調(diào)控，但最終將由凋亡執(zhí)行蛋白caspase-3來啟動凋亡程序，caspase-3激活導(dǎo)致DNA斷裂，核染色質(zhì)濃縮，細(xì)胞凋亡［15-16］。由實(shí)驗(yàn)可知，OGD/R誘導(dǎo)可使caspase-3表達(dá)增加約2.5倍，EGb761可使OGD/R損傷后的細(xì)胞caspase-3表達(dá)量顯著降低。結(jié)果表明EGb761可抑制caspase-3激活從而對抗OGD/R誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡，這可能是其抗細(xì)胞凋亡作用機(jī)制的環(huán)節(jié)之一。

綜上所述，EGb761能夠改善OGD/R誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，這一作用的發(fā)揮可能與調(diào)整bcl-2/bax之間的比值平衡、caspase-3激活從而對抗OGD/R誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)。

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