HPLC法同時檢測肉制品中9種防腐劑和甜味劑

關(guān)麗麗，夏文娟，盧志曉，高源，李彥，梁君妮，沙美蘭，牟妍，曹鵬，*

（1.煙臺出入境檢驗檢疫局，山東煙臺264000；2.張裕集團有限公司白蘭地分公司，山東煙臺264000；3.日照出入境檢驗檢疫局，山東日照276826）

甜味劑和防腐劑作為一類重要的食品添加劑被廣泛用于食品生產(chǎn)加工，這類食品添加劑本身不能向人體提供營養(yǎng)物質(zhì)。在我國食品衛(wèi)生管理辦法中，目前國家批準(zhǔn)使用的食品添加劑種類很多，其用量也有嚴(yán)格規(guī)定[1]，但是部分不法食品生產(chǎn)者經(jīng)營者出于贏利等目的，在食品中超范圍或超限量使用食品添加劑。甜味劑（糖精鈉等）和防腐劑（山梨酸、苯甲酸等）在市場上已有濫用的趨勢，給食品安全帶來隱患，對消費者的健康造成直接的威脅[2]。對羥基苯甲酸酯類是新一代高效低毒消毒殺菌防腐劑，相比于苯甲酸和山梨酸及其鹽類，此類物質(zhì)的抗菌能力強，應(yīng)用的pH 范圍廣，用量低，并且使用安全，經(jīng)濟方便，對人體刺激較小。但Roufledge 等[3]發(fā)現(xiàn)對羥基苯甲酸酯具有弱雌激素活性，這一發(fā)現(xiàn)對原有的對羥基苯甲酸酯低毒性的觀點提出了挑戰(zhàn)。歐盟明確規(guī)定：以對羥基苯甲酸計，食品中對羥基苯甲酸酯的最高允許含量為0.1%，當(dāng)幾種對羥基苯甲酸酯復(fù)配使用時，其總量不得超過0.1%。

現(xiàn)用于檢測食品中添加劑的檢測方法主要有高效液相色譜法[4-7]、高效液相色譜-質(zhì)譜法[8]、氣相色譜法[9-13]及氣相色譜-質(zhì)譜法[14]等。氣相色譜法存在樣品前處理步驟繁瑣、靈敏度不高的弱點，而現(xiàn)有的高效液相色譜法存在檢測種類少的問題。同時現(xiàn)有方法測定的基質(zhì)多為飲料等[15]，對于豬肉及熏煮香腸中防腐劑和甜味劑的檢測卻鮮有報道，而且沒有山梨酸、苯甲酸等防腐劑同對羥基苯甲酸酯一起檢測的方法。因此本研究為提高工作效率，更好地適應(yīng)食品檢測分析工作的需求和發(fā)展趨勢，采用高效液相色譜法同時測定了豬肉中及熏煮香腸中的9 種甜味劑和防腐劑，樣品前處理簡單，檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Aglient 1100 高效液相色譜儀配有二級管陣列檢測器（DAD）：美國安捷倫；Rios8 milli-QG 超純水儀：美國密理博；ZJ000832 電子天平（精確至0.01 g）：長沙湘平科技發(fā)展有限公司；VORTEX-2 GENIE 漩渦混合器：Scientific Industries；KQ-500E 超聲波清洗機：昆山市超聲儀器有限公司；CF16RXⅡ離心機：日本HITACHI。

甲醇、乙腈HPLC 純（德國Merck），水為超純水，乙酸鋅、亞鐵氰化鉀、乙酸鉛、乙酸銨、三氯乙酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、草酸鉀和鎢酸鈉均為分析純。標(biāo)準(zhǔn)品：山梨酸、苯甲酸、糖精鈉（國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心），對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸乙酯、對羥基苯甲酸丙酯、對羥基苯甲酸丁酯、安賽蜜、脫氫醋酸純度均＞99.0%，購自Dr.Ehrenstorfer 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 前處理方法

稱取5.0 g 經(jīng)均質(zhì)處理的樣品于50 mL 比色管中，向比色管中加入30 mL 甲醇-磷酸鹽緩沖溶液（1+1）、1 mL 1%三氯乙酸振蕩超聲30 min，漩渦振蕩5 min，然后用甲醇-磷酸鹽緩沖溶液（1+1）定容至刻度，5 000 r/min 離心5 min。取上清液過0.2 μm 有機相濾膜，供HPLC 儀器分析。

1.2.2 色譜條件

色譜柱：phenomenex Gemini C18（250×4.6 mm，5 μm）；柱溫：25 ℃；流速：1 mL/min；流動相：甲醇和0.02 mol/L 乙酸銨，梯度洗脫程序：0～5 min，10%～35%甲醇；5 min ～15 min，35%～74%甲醇；15 min ～20 min，74 %～90 %甲醇；20 min ～25 min，90 %～10 %甲醇。Agilent DAD 檢測器，檢測波長：230 nm 和254 nm；進樣量：20 μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取液的選擇

本研究比較了甲醇水（1 ∶1）溶液、甲醇磷酸鹽緩沖溶液（pH=6.8）（1 ∶1）、乙腈水（1 ∶1）和乙腈磷酸鹽緩沖溶液（pH=6.8）（1 ∶1）4 種提取液對9 種組分同時提取的提取效果，結(jié)果表明4 種提取液的提取效果均可達到檢測需要。其中乙腈水和乙腈磷酸鹽緩沖溶液凈化效果優(yōu)于甲醇水溶液和甲醇磷酸鹽緩沖溶液，但是乙腈水和乙腈磷酸鹽緩沖溶液提取會導(dǎo)致安賽蜜和糖精鈉出現(xiàn)前展峰，通過調(diào)節(jié)流動相比例及pH 峰型仍無明顯改善，且乙腈較甲醇毒性大、成本高，因此綜合考慮后不選擇含乙腈的提取液。同時發(fā)現(xiàn)甲醇磷酸鹽緩沖溶液回收率高于甲醇水溶液，且相對凈化負(fù)擔(dān)小，因此本研究采用甲醇磷酸鹽緩沖溶液（pH=6.8）（1 ∶1）作為提取液。四種提取液提取效率圖見圖1。

圖1 4 種提取液提取效率比較Fig.1 The comparison of extraction efficiency with different extraction solvents

2.2 沉淀劑的選擇

由于豬肉中及其熏煮香腸基質(zhì)復(fù)雜，含有較多的蛋白質(zhì)、脂肪等，因此需要選擇合適的沉淀劑進行進一步的凈化。食品添加劑檢測常用的沉淀劑有亞鐵氰化鉀-乙酸鋅；硫酸-鎢酸鈉；乙酸鉛、草酸鉀-磷酸氫二鉀等沉淀體系及三氯乙酸、冰醋酸等溶液，其中亞鐵氰化鉀-乙酸鋅沉淀體系通過絡(luò)合效應(yīng)使蛋白質(zhì)等物質(zhì)沉淀，而后幾種沉淀劑均是通過使蛋白質(zhì)變性達到凈化效果。本研究通過比較幾種沉淀劑在豬肉中及其熏煮香腸基質(zhì)的凈化效果，發(fā)現(xiàn)亞鐵氰化鉀-乙酸鋅沉淀體系和三氯乙酸的凈化效果較其它幾種好，但是亞鐵氰化鉀-乙酸鋅沉淀體系由于沉淀能力過強，會使山梨酸和苯甲酸回收率降低約10%，而1%三氯乙酸沉淀效果好且回收穩(wěn)定，因此本研究采用1%三氯乙酸作為沉淀劑。

2.3 檢測波長的確定

安賽蜜、苯甲酸、山梨酸、糖精鈉、脫氫乙酸、對羥基苯甲酸酯類化合物因其結(jié)構(gòu)不同，在紫外區(qū)的特定吸收波長也不同，本研究用標(biāo)準(zhǔn)溶液在190 nm～800 nm波長下進行3D 光譜掃描，發(fā)現(xiàn)各自的最大吸收波長分別為安賽蜜226 nm、苯甲酸224 nm、山梨酸254 nm、糖精鈉202 nm、脫氫乙酸230 nm、對羥基苯甲酸酯類化合物254 nm，與已有文獻報道一致[1-12]。其中安賽蜜、苯甲酸、脫氫乙酸在230 nm 處有較高的靈敏度，而對羥基苯甲酸酯類化合物、山梨酸在254 nm 處紫外吸收較高，在230 nm 處吸收偏低，綜合考慮9 種物質(zhì)的靈敏度，本研究最終選擇在230 nm 和254 nm 兩種波長下同時檢測9 種添加劑，標(biāo)準(zhǔn)品液相色譜圖見圖2。

圖2 標(biāo)準(zhǔn)品液相色譜Fig.2 Chromatogram of standard solution

2.4 線性范圍、標(biāo)準(zhǔn)曲線方程及定量限

在實驗條件下，以峰面積Y 為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度X（mg/L）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性方程，以基線噪聲10 倍峰面積對應(yīng)的各組分質(zhì)量濃度為定量限（S/N=10），7 種防腐劑和2 種甜味劑標(biāo)準(zhǔn)曲線方程、線性范圍和定量限見表1。

表1 9 種目標(biāo)物的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)和定量限Table 1 Standard curve equations，linear ranges，correlation coefficients and limits of quantification of 9 target analytes

2.5 方法回收率及精密度

在不同的熏煮香腸和豬肉樣品中添加文中所測防腐劑和甜味劑，分別添加3 個不同濃度水平的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個水平重復(fù)測定6 次，采用外標(biāo)法進行定量，計算回收率和精密度。試驗結(jié)果表明本方法9 種防腐劑和甜味劑的回收范圍85.25%～98.26%，RSD 值為1.26%～5.39%（詳見表2），表明本方法有良好的精密度和準(zhǔn)確度，滿足分析要求。

表2 樣品中9 種目標(biāo)物的回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）Table 2 Recoveries and relative standard deviations of 9 target analytes spiked in the sample（n=6）

續(xù)表2 樣品中9 種目標(biāo)物的回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）Table 2 Recoveries and relative standard deviations of 9 target analytes spiked in the sample（n=6）

圖3 檢出山梨酸的火腿腸色譜圖Fig.3 Chromatogram of ham containing sorbic acid

2.6 實際樣品測定

采用本方法對市售7 種熏煮香腸和3 種豬肉進行檢測，所測7 種熏煮香腸中均檢出山梨酸，其中一種火腿腸所測山梨酸含量為70 mg/kg（色譜圖見圖3），豬肉中均未檢出文中所測防腐劑和甜味劑。國家規(guī)定肉類制品中山梨酸的限量為0.075 g/kg，熏煮香腸中山梨酸的限量為1.5 g/kg，因此所測熏煮香腸符合國家標(biāo)準(zhǔn)要求。

3 結(jié)論

本研究建立了測定豬肉及熏煮香腸中7 種防腐劑和2 種甜味劑的高效液相色譜法，樣品經(jīng)甲醇-磷酸鹽緩沖溶液（1+1）、1 mL 1%三氯乙酸振蕩超聲、漩渦振蕩提取，phenomenex Gemini C18 色譜柱分離后于230 和254 nm 下定性、定量分析，外標(biāo)法定量。該方法靈敏度高、操作簡單高效，適用于豬肉及熏煮香腸中7種防腐劑和2 種甜味劑定性、定量分析。

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