糖水水果罐頭中主要腐敗微生物的分離純化及鑒定研究

許美玲，張?chǎng)危瑮罹?，陳偉，杜震，董麗君，張麗，周洪娟，郝建?/p>

（臨沂出入境檢驗(yàn)檢疫局，山東臨沂276034）

罐頭是我國(guó)具有傳統(tǒng)特色的產(chǎn)業(yè)，是我國(guó)主要的加工食品，在出口食品中占有重要地位。其中，水果罐頭是國(guó)內(nèi)外罐頭食品市場(chǎng)頗受歡迎的產(chǎn)品，約占罐頭總產(chǎn)量的25%，具有較大的發(fā)展前景[1-2]。糖水水果罐頭雖然經(jīng)過(guò)殺菌處理，但有時(shí)在罐頭食品中仍然可能有微生物存在，導(dǎo)致水果罐頭中果肉發(fā)生腐敗變質(zhì)。對(duì)由于不同罐頭制品營(yíng)養(yǎng)環(huán)境各不相同，其污染菌也不盡相同，在實(shí)際檢測(cè)中常常采取不同性質(zhì)的培養(yǎng)基利于檢出特定的污染菌[3]。為防止水果罐頭腐敗變質(zhì)，延長(zhǎng)貨架期，保護(hù)我國(guó)消費(fèi)者健康安全及出口食品安全，本文旨在對(duì)糖水水果罐頭中的污染微生物進(jìn)行分析，探索糖水水果罐頭中微生物檢測(cè)方法，降低微生物污染率。同時(shí)，也為罐頭食品微生物檢測(cè)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 樣品來(lái)源

草莓罐頭、黃桃罐頭：來(lái)源于工廠發(fā)生腐敗變質(zhì)的罐頭，罐內(nèi)果肉組織解體。

1.1.2 培養(yǎng)基

1）硫乙醇酸鹽液體培養(yǎng)基（FT）、錳鹽營(yíng)養(yǎng)瓊脂、酸性肉湯、溴甲酚紫葡萄糖肉湯、皰肉培養(yǎng)基基礎(chǔ)、麥芽浸膏湯均購(gòu)自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司。

2）嗜熱耐酸芽孢桿菌培養(yǎng)基：酵母浸膏5 g，蛋白胨5 g，葡萄糖5 g，磷酸氫二鉀4 g，瓊脂粉18 g，水1 000 mL，121 ℃，15 min 高壓滅菌。

3）AC 瓊脂：酵母浸膏3g，蛋白胨20g，牛肉膏3g，麥芽浸膏3 g，葡萄糖5 g，VC0.2 g，瓊脂粉18 g，水1 000 mL，121 ℃，15 min 高壓滅菌。

4）硫乙醇鈉瓊脂培養(yǎng)基：按每100 mL 硫乙醇胺肉湯加入1.5%～2.0%瓊脂粉，121℃，15 min 高壓滅菌。

1.1.3 試劑

細(xì)菌瓊脂粉、葡萄糖、胰酪蛋白胨、麥芽浸粉、牛肉浸粉、酵母浸膏、牛肉膏、蛋白胨均購(gòu)自北京陸橋生物技術(shù)有限公司；磷酸氫二鉀、氯化錳均為分析純；BD生化鑒定板條購(gòu)自美國(guó)BD 生物技術(shù)有限公司。

1.1.4 儀器

MOS-3020 SNAYO 高壓滅菌鍋、MIR-253 生化培養(yǎng)箱：日本三洋電子有限公司；BUG BOX M 厭氧微生物培養(yǎng)工作站：英國(guó)RUSKINN 公司；CLASSⅡTYPE A2 生物安全柜：北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；PHOENIX 100 微生物鑒定儀：美國(guó)BD 設(shè)備有限公司；BX41 OLYMPUS 生物顯微鏡：日本奧林巴斯公司。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)方式

采用35、55 ℃兩種溫度；有氧與厭氧環(huán)境。

1.2.2 密封性檢驗(yàn)

將罐頭制品放入水中，觀察有無(wú)氣泡產(chǎn)生[4]。

1.2.3 內(nèi)容物增菌

將待測(cè)樣品放置在超凈工作臺(tái)上，開(kāi)啟紫外燈30 min后，用75%酒精進(jìn)行表面消毒。用滅菌開(kāi)罐器開(kāi)啟罐頂，如系胖聽(tīng)罐頭可用注射器吸取少許罐頭內(nèi)氣體用以鑒定氣體種類。無(wú)菌取出罐頭樣品至均質(zhì)袋內(nèi)均質(zhì)，分別取1 mL 內(nèi)容物轉(zhuǎn)入皰肉肉湯、溴甲酚紫葡萄糖肉湯、麥芽浸膏肉湯、硫乙醇酸鈉肉湯、酸性肉湯增菌培養(yǎng)基中，分別在35、55 ℃兩種溫度下連續(xù)培養(yǎng)96 h，每24 小時(shí)觀察記錄一次。

1.2.4 分離培養(yǎng)

分別選用皰肉瓊脂培養(yǎng)基、溴甲酚紫葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、硫乙醇酸鈉瓊脂培養(yǎng)基、嗜熱耐酸芽孢桿菌培養(yǎng)基、AC 瓊脂培養(yǎng)基、麥芽浸膏瓊脂培養(yǎng)基進(jìn)行分離培養(yǎng)。連續(xù)培養(yǎng)120 h，每24 小時(shí)觀察記錄試驗(yàn)現(xiàn)象。

1.2.5 純培養(yǎng)

將各培養(yǎng)基中培養(yǎng)物挑取單菌落分別接種到與其相對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)基中，進(jìn)行純培養(yǎng)。

1.2.6 厭氧培養(yǎng)和高溫驗(yàn)證試驗(yàn)

將有氧分離的純培養(yǎng)物接種到皰肉瓊脂培養(yǎng)基、溴甲酚紫葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、硫乙醇酸鈉瓊脂培養(yǎng)基、嗜熱耐酸芽孢桿菌培養(yǎng)基、AC 瓊脂培養(yǎng)基、麥芽浸膏瓊脂培養(yǎng)基，分別置于厭氧微生物工作站中，在35、55 ℃以及有氧環(huán)境55 ℃條件下培養(yǎng)。55 ℃條件下培養(yǎng)的培養(yǎng)基在培養(yǎng)96 h 后放入35 ℃條件下繼續(xù)培養(yǎng)48 h，觀察并記錄實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象。

1.2.7 鑒定方法

采取革蘭氏染色、芽孢染色[5]等染色方法相結(jié)合的方式對(duì)試驗(yàn)中的微生物進(jìn)行鑒定，根據(jù)其生長(zhǎng)特征、生理特征、外觀形態(tài)并結(jié)合細(xì)菌鑒定手冊(cè)[6]、伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)[7]進(jìn)行進(jìn)一步判斷，最后利用微生物鑒定儀進(jìn)行菌種綜合鑒定。

2 結(jié)果與討論

2.1 罐頭密封性檢測(cè)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)所用罐頭密封性良好，放入水中并未產(chǎn)生氣泡。草莓罐頭內(nèi)容物的pH 經(jīng)測(cè)定為2.88，黃桃罐頭內(nèi)容物的pH 為3.46，同批次正常草莓罐頭和黃桃罐頭的pH 范圍分別為3.4～3.6 和3.6～4.0，草莓罐頭發(fā)生了酸化，pH 降低，而黃桃罐頭pH 在正常范圍內(nèi)。因pH小于4.6，屬于酸性罐頭。本次實(shí)驗(yàn)所選用的兩種糖水水果罐頭均未發(fā)現(xiàn)胖聽(tīng)現(xiàn)象。

2.2 罐頭中腐敗微生物增菌結(jié)果及分析

不同增菌液的增菌效果見(jiàn)表1。

表1 黃桃罐頭、草莓罐頭中腐敗微生物增菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 1 Choice of optical medium for enriching spoilage bacteria isolated from canned peach and canned strawberry in various media respectively

由表1 可以看出，在培養(yǎng)24h 內(nèi)未發(fā)現(xiàn)菌落生長(zhǎng)現(xiàn)象，培養(yǎng)48 h 后培養(yǎng)基出現(xiàn)不同程度的渾濁現(xiàn)象，溴甲酚紫葡萄糖肉湯紫色褪去，皰肉肉湯中出現(xiàn)產(chǎn)酸產(chǎn)氣現(xiàn)象。黃桃罐頭在35 ℃條件下，在硫乙醇酸鈉肉湯中培養(yǎng)效果最好，在溴甲酚紫葡萄糖肉湯中未見(jiàn)生長(zhǎng)，在55 ℃培養(yǎng)條件下，未見(jiàn)生長(zhǎng)。草莓罐頭在35 ℃條件下，在酸性肉湯、麥芽浸膏肉湯中培養(yǎng)效果最好，在55 ℃條件下，在溴甲酚紫葡萄糖肉湯、麥芽浸膏肉湯中培養(yǎng)效果最好，在兩種溫度下，酸性肉湯中未見(jiàn)生長(zhǎng)。

2.3 罐頭中腐敗微生物分離、純化與培養(yǎng)

2.3.1 罐頭中腐敗微生物分離培養(yǎng)結(jié)果與分析

腐敗微生物分培養(yǎng)結(jié)果見(jiàn)表2。

在進(jìn)行分離培養(yǎng)時(shí)，黃桃罐頭在皰肉瓊脂培養(yǎng)基、溴甲酚紫葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基和硫乙醇酸鈉瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)效果最好，草莓罐頭在皰肉瓊脂培養(yǎng)基、AC 瓊脂培養(yǎng)基和嗜熱耐酸芽孢桿菌培養(yǎng)基上分離培養(yǎng)效果最好。所有培養(yǎng)基在24 h 內(nèi)均為發(fā)現(xiàn)菌落生長(zhǎng)，培養(yǎng)48 h 后培養(yǎng)效果漸佳。

2.3.2 罐頭中腐敗微生物純培養(yǎng)結(jié)果與分析

罐頭中腐敗微生物純培養(yǎng)結(jié)果見(jiàn)表3。

表2 罐頭中腐敗微生物培養(yǎng)基分離篩選結(jié)果Table 2 Growth status of spoilage bacteria isolated from canned peach and canned strawberry in various media respectively

表3 罐頭中腐敗微生物純培養(yǎng)結(jié)果Table 3 Growth status of pure culture of spoilage bacteria isolated from canned peach and canned strawberry in various media respectively

在皰肉瓊脂培養(yǎng)基、溴甲酚紫葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、硫乙醇酸鈉瓊脂培養(yǎng)基上，分離得到的單菌落生長(zhǎng)狀況最佳，在24 h 時(shí)即可達(dá)到較好的生長(zhǎng)狀態(tài)。而其他幾種培養(yǎng)基也有生長(zhǎng)，但生長(zhǎng)緩慢。由此可以看出，皰肉瓊脂培養(yǎng)基、溴甲酚紫葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、硫乙醇酸鈉瓊脂培養(yǎng)基是較好的純化培養(yǎng)基，其他培養(yǎng)基生長(zhǎng)效果較差。

2.3.3 罐頭中腐敗微生物厭氧培養(yǎng)結(jié)果與分析

通過(guò)對(duì)純化的4 株菌株進(jìn)行厭氧培養(yǎng)，48 h 時(shí)觀察結(jié)果發(fā)現(xiàn)，A 菌株在厭氧條件下不生長(zhǎng)，B、C、D 菌株在厭氧條件下生長(zhǎng)良好。

2.4 罐頭中腐敗微生物的鑒定

2.4.1 菌落形態(tài)特征和鏡檢結(jié)果

分離的腐敗微生物菌落形態(tài)及革蘭氏染色鏡檢結(jié)果見(jiàn)表4。

2.4.2 微生物鑒定儀鑒定結(jié)果

根據(jù)對(duì)分離純化菌株革蘭氏染色結(jié)果，選擇BD細(xì)菌的快速鑒定板條，系統(tǒng)給出的鑒定結(jié)果見(jiàn)表5。

表4 罐頭中污染菌形態(tài)觀察Table 4 Cell morphology of bacterium in canned peach and canned strawberry

表5 分離到的微生物鑒定結(jié)果Table 5 The identification results of the isolated micro-organism

3 結(jié)論

1）罐頭食品中的微生物受食品中的pH 的影響

罐頭食品按pH 的不同可分為低酸性食品和酸性食品，pH≥4.6 為低酸性食品，pH≤4.6 為酸性食品。糖水水果罐頭pH 在2.5～3.5 之間，故糖水水果罐頭為酸性食品。酸性罐頭食品能生長(zhǎng)繁殖的耐酸的微生物無(wú)論在數(shù)量上還是在種類上都遠(yuǎn)比低酸性罐頭食品少。微生物生長(zhǎng)環(huán)境不同，分離得到的污染菌也不盡相同。因此，選擇合適的增菌肉湯及分離培養(yǎng)基尤其重要。通過(guò)糖水水果罐頭在不同增菌培養(yǎng)基及分離培養(yǎng)基分離結(jié)果，可以看出：黃桃罐頭硫乙醇酸鈉肉湯中增菌效果最好，在皰肉瓊脂培養(yǎng)基、溴甲酚紫葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基和硫乙醇酸鈉瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)效果最好，這與史振霞等的研究結(jié)果類似[8]；草莓罐頭在酸性肉湯、麥芽浸膏肉湯中增菌效果最佳，在皰肉瓊脂培養(yǎng)基、AC 瓊脂培養(yǎng)基和嗜熱耐酸芽孢桿菌培養(yǎng)基上分離培養(yǎng)效果最好。

2）通過(guò)生化實(shí)驗(yàn)，結(jié)合細(xì)菌鑒定手冊(cè)、伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)和BD 微生物鑒定儀，發(fā)現(xiàn)黃桃罐頭、草莓罐頭腐敗過(guò)程中滋生的主要微生物為：A 菌為成團(tuán)泛菌（Pan.agglomerans）；B 和C 菌株為同一種菌，為地衣芽孢桿菌（Baci. licheniformis）；D 菌為蠟樣芽孢桿菌（Baci.cereus）。

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