肽酰亞胺類農(nóng)藥多克隆抗體的制備與鑒定

王松，王駿，宮萍，高建國，劉潤珠，王亞恩，辛學(xué)謙，王建華

（1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所，山東青島266071；2.山東出入境檢驗檢疫局食品農(nóng)產(chǎn)品中心，山東青島266002）

克菌丹、滅菌丹和敵菌丹是一類多作用點的廣譜保護(hù)性殺菌劑，同屬于酞酰亞胺類。可與大多數(shù)常規(guī)農(nóng)藥混用，主要用于防治果樹、蔬菜和經(jīng)濟(jì)作物上多種病害。但這些農(nóng)藥均對人體有生物毒性，一經(jīng)攝入會嚴(yán)重影響人體健康。國家農(nóng)藥殘留標(biāo)準(zhǔn)中已嚴(yán)格規(guī)定其在糧食和蔬菜中的限量（0.01 mg/kg）[1]，但違禁使用現(xiàn)象仍較嚴(yán)重，需建立快速、靈敏的檢測方法，對其加強(qiáng)監(jiān)測，故開展本研究對保障人民身體健康與保護(hù)環(huán)境具有重要意義。目前酞酰亞胺類農(nóng)藥殘留檢測方法主要有液相色譜法[2]、氣相色譜法或氣質(zhì)聯(lián)用法[3]。這些方法前處理過程復(fù)雜，檢測時間長，費用高，操作人員易接觸有毒有機(jī)溶劑和化學(xué)試劑。而液相柱后衍生不好掌握，這兩種分析方法都存在一定的局限性。近年來，酶免疫測定法（Enzyme-linked Immunosorbent assay，ELISA）受到廣泛重視，此檢測法靈敏度高，特異性強(qiáng)，儀器設(shè)備要求低和樣本前處理相對簡單等優(yōu)點，適于現(xiàn)場監(jiān)控和大量樣本篩查。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

1.1.1 供試藥品和試驗動物

克菌丹（純度=98）、敵菌丹（純度=98.5%）、滅菌丹（純度=98.5%）：德國Dr；牛血清白蛋白：BSA；N 一經(jīng)基唬泊酞亞胺：NHS；水溶性碳化二亞胺：EDC；弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、酶標(biāo)二抗等：Sigma 公司；酶聯(lián)免疫吸附測定中所用的試劑均為國產(chǎn)分析純試劑，按照文獻(xiàn)[11]自配。實驗動物為健康雄性新西蘭大白兔：中科院基因研究所動物實驗中心。

1.1.2 儀器

臺式高速冷凍離心機(jī)：日立公司；酶標(biāo)儀、紫外可見分光光度計：島津公司；二氧化碳培養(yǎng)箱、Nexus 670型傅立葉變換紅外光譜儀：Nieolet 公司。

1.2 方法

1.2.1 人工抗原制備

1.2.1.1 半抗原活化

取3.0 g TPHI 鉀鹽溶于15 mL 含1.1 g KOH 乙醇中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，加入3.6 g 5-溴戊酸。加入4 mL DMF（N-甲酰二胺）索氏提取16 h。將反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)移至分液漏斗，加入45 mL 稀HCL，再用60 mL 二氯甲烷進(jìn)行萃取。取有機(jī)相加入30 mL 5%NaHCO3進(jìn)行提取，稀HCL 酸化，再加入30 mL 二氯甲烷，重復(fù)二次后，干燥，產(chǎn)物采用薄層層析鑒定。原理如圖1。

圖1 半抗原活化Fig.1 Activation of Hapten

1.2.1.2 與載體蛋白偶聯(lián)

采用EDC 方法（碳二亞胺）將半抗原與與載體蛋白相偶聯(lián)[12]，稱取40 μmoL 的THPI 衍生物，溶于1.0 mL 0.05 mol/L PB PH7.0，加入100 mg EDC，再1.5 mL 28 mg BSA（牛血清白蛋白），4 ℃攪拌反應(yīng)18 h～24 h。見圖2。

圖2 半抗原與載體蛋白偶聯(lián)Fig.2 Hapten conjugated with bovine seraalbumin（BSA）

1.2.2 動物免疫

取3 mg 蛋白與弗氏完全佐劑（Sigma）混勻乳化，取體重2 kg 大耳白兔，背部皮下多點注射抗原。兩周后，取1.5 mg 蛋白溶液與弗氏不完全佐劑（Sigma）混勻乳化，進(jìn)行皮下第二次免疫。以后每隔4 周，進(jìn)行第三、四次免疫，耳靜脈采血。

1.2.3 抗體檢測

1）抗血清采用正辛酸一硫酸銨二步法[13]沉淀純化。

2）間接法檢測抗體效價[13]。

3）制作農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線[13]。

1.3 競爭法ELISA[14]檢測農(nóng)藥

1.4 3 種農(nóng)藥多抗交叉反應(yīng)測定[14]

將3 種酞酰亞胺類農(nóng)藥和其他結(jié)構(gòu)農(nóng)藥配制成質(zhì)量濃度為1 g/L 的儲備溶液，然后取少量用PBS 10倍比稀釋成不同質(zhì)量濃度溶液，每個質(zhì)量濃度取50 μI與50 μI 工作濃度的多抗血清混合，加到按1.2.3.2 項方法包被封閉好的酶標(biāo)板內(nèi)，37 ℃反應(yīng)l h；然后按1.2.3 中2）項步驟加羊抗兔IgG—HRP、加底物、終止反應(yīng)并測定OD450值等進(jìn)行；同時設(shè)陰性對照和空白對照孔。通過計箅得出多抗與其他類農(nóng)藥的交叉反應(yīng)率，按以下公式計算：

式中：B0為不含農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品孔（0 mg/L）的吸光值減去含最大濃度農(nóng)藥準(zhǔn)品孔（100 mg/L）吸光值；B為其余質(zhì)量濃度農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品孔的吸光值減去含最大質(zhì)量濃度農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品孔的吸光值。以C 為橫坐標(biāo)（C 為農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量濃度），抑制率為縱半標(biāo)，建立檢測農(nóng)藥的標(biāo)準(zhǔn)曲線；根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性方程，計算產(chǎn)生20 %抑制率（B/B=80 %）時所需的農(nóng)藥的質(zhì)量濃度（IC20值），以IC20值為最小檢測限。其他類農(nóng)藥的標(biāo)準(zhǔn)曲線建立方法與農(nóng)藥的標(biāo)準(zhǔn)曲線方法相同。根據(jù)相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計算對應(yīng)的其他類農(nóng)藥產(chǎn)生50 %的抑制率時所需要的相應(yīng)農(nóng)藥的濃度（IC50值）。

1．5 抗體特異性檢測[14]

取3 種酞酰亞胺類農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品敵菌丹、克菌丹、滅菌丹和3 種有機(jī)磷類農(nóng)藥以及三氯殺螨醇、百菌清、莠去津等稀釋成系列質(zhì)量濃度梯度（10-1mg/mL），進(jìn)行交叉反應(yīng)實驗，以此評價抗體特異性。

1.6 添加回收率的測定

稱取10 g 蘋果，按0.025 mg/kg～5.0 mg/kg 分別添加敵菌丹、克菌丹及滅菌丹，每個濃度設(shè)6 個重復(fù)，用間接ELISA 法對樣品進(jìn)行分析，上樣量為50 μL，測定樣品的吸光值，由平均吸光值計算抑制率，再利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計算農(nóng)藥殘留濃度。計算該方法的回收率和變異系數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗體效價測定

抗體效價血清效價定為（P/N）2.1，結(jié)果顯示，當(dāng)包被原濃度為1.0 mmol/L 時，TPHI-BSA 抗血清效價達(dá)2.56×104，抗體純化后凍干粉的效價則達(dá)5.12×104。這說明免疫原的合成是成功的，而且純化后抗體的效價有所提高。

2.2 間接競爭法ELISA 檢測農(nóng)藥

2.2.1 ELISA 工作條件的確定

用系列濃度的包被抗原包被酶標(biāo)板，將抗血清作梯度稀釋，同時在酶標(biāo)板上用方陣滴定法進(jìn)行測定。選擇OD 值在1.0 左右，且抗原抗體用量最少的抗原包被物濃度和抗血清的稀釋度為最適工作濃度。結(jié)果確定本試驗中包被抗原最適工作濃度為10.0 μg/mL，抗血清最適稀釋度為1 ∶8 000。

2.2.2 THPI 衍生物抗血清與農(nóng)藥免疫反應(yīng)

以農(nóng)藥作為競爭抑制抗原，間接競爭ELISA 法檢測不同濃度敵菌丹對抗體的抑制情況。包被濃度為0.12 μg/mL，抗體稀釋度為8000。以農(nóng)藥濃度的值（ng/mL）為橫坐標(biāo)，以O(shè)D450為縱坐標(biāo)，繪制敵菌丹抑制率曲線，對曲線進(jìn)行線性回歸，結(jié)果表明THPI 衍生物抗血清對敵菌丹抑制率得到回歸方程為y=-35.801 LnX+73.279，R2=0.990 3，IC50約為250 ng/mL，檢測限為30 ng/mL。如圖3。

圖3 THPI 抗血清ELISA 競爭法檢測敵菌丹抑制曲線圖Fig.3 Inhibition curve of captafol by indirect ELISA for immunized THPI antisera

THPI 衍生物抗血清對克菌丹（captan）抑制率得到回歸方程為y=-41.424Lnx+88.94，R2=0.989 2，IC50約為200 ng/mL，檢測限為15.0 ng/mL。如圖4。

2.3 3 種農(nóng)藥多抗交叉反應(yīng)及兩種抗血清特異性檢測

2.3.1 TPHI 衍生物抗血清特異性檢測

間接競爭ELISA 法檢測結(jié)果顯示TPHI 抗血清對克菌丹、敵菌丹IC50值為0.2 μg/mL～0.3 μg/mL 之間，滅菌丹IC50為0.588 μg/mL，與克菌丹交叉反應(yīng)率大于90%，與滅菌丹交叉反應(yīng)率大于50%；與其他類型農(nóng)藥反應(yīng)IC50值均大于100 μg/mL 交叉反應(yīng)率小于1.26%。

圖4 THPI 衍生物抗血清ELISA 競爭法檢測克菌丹抑制曲線圖Fig.4 Inhibition curve of captan by indirect ELISA for immunized THPI antisera

2.4 TPHI 衍生物抗血清添加回收檢測

檢測結(jié)果顯示當(dāng)農(nóng)藥添加濃度在0.25 μg/mg～5.0 μg/mg 之間時TPHI 衍生物分別對蘋果樣品中的3種農(nóng)藥的平均回收率在80%～100%之間，變異系數(shù)在2%～10 %之間。

3 討論

合成有效的半抗原是獲得小分子物質(zhì)特異性單克隆抗體的前提，半抗原分子的結(jié)構(gòu)決定了抗體的特異性與親和性。因此免疫半抗原的分子設(shè)計是建立小分子免疫化學(xué)分析的關(guān)鍵。由于酞酰亞胺類農(nóng)藥是芳香環(huán)結(jié)構(gòu)的小分子化合物，其本身不能作為免疫原。為了使該化合物具有免疫原性，需先合成帶有活性基團(tuán)常用為羧基與氨基，也可為巰基，再通過這些基團(tuán)連接到載體蛋白如BSA，這樣免疫動物才能產(chǎn)生特異抗體。由于與酞酰亞胺類農(nóng)藥的芳香環(huán)部分相近似，因此從THPI（Tetrahydrophthalimide）出發(fā)合成酞酰亞胺類農(nóng)藥半抗原，由此進(jìn)行免疫動物獲得酞酰亞胺類農(nóng)藥廣譜特異性抗體。

1）本實驗通過經(jīng)5-溴戊酸活化THPI 與BSA 構(gòu)建半抗原，同時保持了酞酰亞胺類農(nóng)藥原有的分子結(jié)構(gòu)特性，通過試驗證明獲得的多克隆抗體可以特異性識別THPI 半抗原而不識別BSA，說明該免疫原免疫動物后可以獲得特異性的多克隆抗體。

2）檢測結(jié)果顯示THPI 抗體檢測克菌丹的IC50約為0.217μg/mL，檢測敵菌丹的IC50約為0.250 μg/mL，靈敏度達(dá)到30 ng/mL 左右，而與滅菌丹反應(yīng)IC50約為0.588 μg/mL，表明THPI 衍生物產(chǎn)生的抗體對敵菌丹、克菌丹識別相對于滅菌丹有一定差異，但特異性不十分顯著。推測可能由于敵菌丹、克菌丹末端為環(huán)己烯結(jié)構(gòu)而滅菌丹為苯環(huán)結(jié)構(gòu)，兩種結(jié)構(gòu)均為具有一定剛性平面結(jié)構(gòu)化合物，屬于較易引起特異性免疫識別結(jié)構(gòu)，由此可能產(chǎn)生免疫識別特異性。說明該實驗獲得的多克隆抗體具備較高特異性的?？梢酝瓿蓪μ啺奉愞r(nóng)藥較為準(zhǔn)確的檢測。

3）添加回收率試驗評價3 種酞酰亞胺類農(nóng)藥ELISA 方法的準(zhǔn)確度和精密度。添加濃度為0.1 μg/mg～5.0 μg/mg 時，該方法蘋果中的添加回收率和變異系數(shù)分別為83.2%～109.6%和2%～9.2%，準(zhǔn)確度和精密度均符合農(nóng)藥殘留分析的要求。均達(dá)到國家相關(guān)農(nóng)藥檢測標(biāo)準(zhǔn)檢測低限。

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