海紅果酒中甲醇比色測(cè)定條件優(yōu)化

楊 輝， 黃麗梅， 羅建華

(1.陜西科技大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院， 陜西 西安 710021； 2.懷來縣貴族莊園葡萄酒業(yè)有限公司， 河北 懷來 075400))

0 引言

甲醇(Methanol)是果酒中的有害成分，也是最重要的衛(wèi)生指標(biāo)之一[1-4].甲醇對(duì)人體的毒性很大，它在人體內(nèi)氧化生成的甲醛和甲酸的毒性也遠(yuǎn)高于甲醇[2]，可致人頭暈、頭痛等，還可造成失明，甚至死亡[2-6].國(guó)內(nèi)有關(guān)毒酒事件的報(bào)道多與甲醇有關(guān)[3]，因此，定期對(duì)海紅果酒中甲醇含量進(jìn)行監(jiān)督檢測(cè)是非常必要的.目前，國(guó)內(nèi)外檢測(cè)食用酒中甲醇含量的方法主要有比色法、氣相色譜法、高效液相色譜法、固定化酶流動(dòng)注射分析法、酶電極法、激光拉曼光譜法、Fourier 變換紅外光譜法、折射法、蒸餾法等[4].

企業(yè)生產(chǎn)中的甲醇檢測(cè)，既要保證結(jié)果的準(zhǔn)確性，又要節(jié)約檢測(cè)成本，準(zhǔn)確及時(shí)地出具檢測(cè)結(jié)果.因此，品紅-亞硫酸法成為許多企業(yè)選擇的檢測(cè)方法[7-12].按照GBT15038-2006中品紅-亞硫酸法進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)所得的標(biāo)準(zhǔn)曲線、回收率、精密度均不理想.為此，本文分析影響品紅-亞硫酸法測(cè)定甲醇含量的各種因素，對(duì)該方法進(jìn)行改進(jìn)，探索靈敏、準(zhǔn)確的甲醇測(cè)定方法.

1 材料與方法

1.1 主要儀器

722型光柵分光光度計(jì)(上海精密儀器有限公司).

1.2 實(shí)驗(yàn)主要試劑

實(shí)驗(yàn)所用的主要試劑：磷酸，天津市天力化學(xué)試劑有限公司，AR；高錳酸鉀，天津海精化工有限公司，AR；草酸，天津市紅巖化學(xué)試劑廠，AR；硝酸銀，天津市天感化學(xué)試劑有限公司，AR；堿性品紅，天津市博迪化工有限公司，AR；無水亞硫酸鈉，天津市化學(xué)試劑六廠三分廠，AR；活性炭，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司，AR.

1.3 試劑的配制

高錳酸鉀-磷酸溶液、草酸-硫酸溶液、品紅-亞硫酸溶液參照GBT 15038-2006配制.

無甲醇的乙醇溶液：首先參照GB/T 15038-2006配制，而后加水配成無甲醇的乙醇溶液(體積分?jǐn)?shù)為40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%和80%).

甲醇標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確吸取1.27 mL甲醇，移入100 mL容量瓶中，加水到刻度，搖勻，此溶液含甲醇10 mg/mL,置低溫保存.

甲醇標(biāo)準(zhǔn)使用液：吸取10 mL甲醇標(biāo)準(zhǔn)溶液，移入100 mL容量瓶中，加水至刻度，搖勻，再吸取25 mL稀釋液，移入50 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，備用.

1.4 試驗(yàn)方法

準(zhǔn)確移取酒樣xmL，加水(5.0-x) mL，加入高錳酸鉀-磷酸溶液2.0 mL，放置10 min后，加入草酸-硫酸溶液2 mL，混勻退色后，再加入品紅-亞硫酸溶液5.0 mL，混勻，于20 ℃以上靜置0.5 h.用2 mL比色杯，以不添加甲醇的試管調(diào)零，于波長(zhǎng)570 nm處測(cè)其吸光度，然后從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查取甲醇含量并計(jì)算其濃度.

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 顯色機(jī)理

甲醇在酸性溶液中，被高錳酸鉀氧化稱甲醛.

上述反應(yīng)中沒有作用完的高錳酸鉀被隨后加入的草酸還原為無色的Mn2+.堿性品紅(三氨基三苯甲烷氯化物)與亞硫酸反應(yīng)生成無色透明的N-亞磺酸亞硫酸副品紅堿，繼而與生成的甲醛反應(yīng)，生成紫紅色醌型結(jié)構(gòu).

從上述顯色機(jī)理可知，凡是影響甲醇被氧化成甲醛以及甲醛穩(wěn)定性的因素都會(huì)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定產(chǎn)生影響，本文將對(duì)草酸溶液用量、無甲醇溶液中乙醇濃度、顯色時(shí)間等對(duì)甲醇標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定的影響進(jìn)行研究.

2.2 最佳吸收波長(zhǎng)的確定

郭廣玲[13]等發(fā)現(xiàn)在波長(zhǎng)為520 nm處，甲醇有最大吸收峰，任紅敏[14]等發(fā)現(xiàn)在波長(zhǎng)為545 nm處，甲醇測(cè)定體系有最大吸收峰，而GBT15038-2006[5]中甲醇測(cè)定的波長(zhǎng)規(guī)定為590 nm.由此可發(fā)現(xiàn)，甲醇測(cè)定的波長(zhǎng)眾說不一，這可能與測(cè)定所用的分光光度計(jì)有關(guān)，因此有必要于所用分光光度計(jì)上測(cè)定最大吸收波長(zhǎng).取1 mL甲醇標(biāo)準(zhǔn)使用溶液，0.3 mL無甲醇的乙醇溶液，0.6 mL草酸-硫酸溶液，按照1.4的試驗(yàn)方法測(cè)其吸光度，可以發(fā)現(xiàn)體系在570 nm有最大吸收，故選用570 nm做為最佳測(cè)定波長(zhǎng).

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定

按照GB/T15038-2006中甲醇標(biāo)準(zhǔn)曲線制作方法，用2 mL比色杯，以0號(hào)管調(diào)零，于波長(zhǎng)570 nm處測(cè)其吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1所示.由圖1可以看出，所測(cè)得的A值比較分散，且曲線線性不好，并且實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，各標(biāo)準(zhǔn)管顏色相差不多，比色較困難.

圖1 甲醇標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4 品紅-亞硫酸法測(cè)定甲醇含量的影響因素

2.4.1 草酸-硫酸用量對(duì)吸光度的影響

在無甲醇的乙醇溶液濃度為60%，加入高錳酸鉀-硫酸后靜置時(shí)間為10 min，顯色溫度為35 ℃的條件下，選取草酸-硫酸的添加量分別為0.4、0.6、0.8、1、1.2、1.4、1.6、1.8和2 mL測(cè)其吸光度，試驗(yàn)結(jié)果如圖2所示.吸光度隨著草酸-硫酸用量的減少而升高，草酸用量過少，不能將過量的高錳酸鉀反應(yīng)完全，致使標(biāo)樣在加入顯色劑之前有顏色，吸光度增大.草酸-硫酸用量過多，甲醛被草酸還原為甲醇[13]，不與顯色劑反應(yīng)，測(cè)量結(jié)果偏低.因此本實(shí)驗(yàn)選取草酸硫酸加入量為0.6 mL，此加入量既能保證將過量的高錳酸鉀反應(yīng)完全，又能確保吸光度最大.

圖2 草酸-硫酸加入量對(duì)吸光度的影響

2.4.2 無甲醇的乙醇溶液濃度對(duì)吸光度的影響

在草酸-硫酸溶液的用量為0.6 mL，加入高錳酸鉀-硫酸溶液的靜置時(shí)間為10 min，顯色溫度為35 ℃的條件下，選取無甲醇的乙醇溶液濃度為40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%和80%測(cè)其吸光度，試驗(yàn)結(jié)果如圖3所示.吸光度隨著無甲醇乙醇溶液的濃度增大而下降，這是由于乙醇濃度越高，其溶液極性越小，越不利于反應(yīng)試劑高錳酸鉀、草酸和顯色劑的電離及其反應(yīng)，相反，無甲醇的乙醇溶液濃度越低，溶液極性越強(qiáng)，顯色反應(yīng)靈敏，吸光度大.由圖可以看出，無甲醇乙醇溶液的濃度為40%時(shí)的吸光度最大，故選擇40%為最佳的無甲醇乙醇溶液的濃度.

圖3 無甲醇的乙醇濃度對(duì)吸光度的影響

2.4.3 靜置時(shí)間對(duì)吸光度的影響

在無甲醇的乙醇溶液濃度為40%，草酸-硫酸溶液的用量為0.6 mL，顯色溫度為35 ℃的條件下，選取加入高錳酸鉀-磷酸后的靜置時(shí)間為5、8 、10 、13 、15 和20 min測(cè)其吸光度，試驗(yàn)結(jié)果如圖4所示.隨著靜置時(shí)間的增加，吸光度呈現(xiàn)先降低后升高再降低的趨勢(shì).靜置時(shí)間過短，加入的草酸-硫酸溶液沒有將過量的高錳酸鉀-磷酸溶液反應(yīng)完全，使加入顯示劑之前，標(biāo)樣有顏色，吸光度增大.而靜置時(shí)間過長(zhǎng)，高錳酸鉀進(jìn)一步將甲醛氧化成甲酸[15]，吸光度降低.故本實(shí)驗(yàn)選取加入高錳酸鉀-磷酸溶液后的靜置時(shí)間為13 min.

圖4 靜置時(shí)間對(duì)吸光度的影響

2.4.4 顯色溫度對(duì)吸光度的影響

在無甲醇的乙醇溶液濃度為40%，加入高錳酸鉀-硫酸溶液后靜置時(shí)間為13 min，草酸-硫酸溶液用量為0.6 mL的條件下，選取顯色溫度為20、25、30、35、40、45、50和55 ℃測(cè)其吸光度，試驗(yàn)結(jié)果如圖5所示.結(jié)果表明隨著顯色溫度的升高，吸光度呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì).溫度是影響反應(yīng)的主要因素之一，在一定范圍內(nèi)，隨著溫度升高，反應(yīng)速率加快，促進(jìn)N-亞磺酸亞硫酸副品紅堿中與碳結(jié)合的—OSO2H基團(tuán)的脫去，顯色明顯，但溫度過高，顯色物質(zhì)(紫紅色醌型結(jié)構(gòu))不穩(wěn)定，分解退色，吸光度下降.其中，40 ℃時(shí)的吸光度最大，為最佳顯色溫度.

圖5 顯色溫度對(duì)吸光度的影響

2.4.5 改進(jìn)后標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

吸取0 、0.1、0.2、0.4、0.6 、0.8和1 mL甲醇標(biāo)準(zhǔn)使用溶液(相當(dāng)于0、0.05、0.1、0.2 、0.3 、0.4 和0.5 mg甲醇)分別置于25 mL的具塞比色管中，對(duì)應(yīng)比色管標(biāo)號(hào)分別為0、1、2、3、4、5、6，然后，分別加入40%的無甲醇的乙醇溶液0.3 mL，加水至 5 mL，再依次加入2 mL高錳酸鉀-磷酸溶液，混勻，放置13 min，各加入草酸-硫酸溶液0.6 mL，各試管補(bǔ)加水1.4 mL，混勻使之退色，再依次加入5 mL品紅-亞硫酸溶液，混勻，于40 ℃靜置0.5 h.用2 mL比色杯，以0號(hào)管調(diào)零，于波長(zhǎng)570 nm處測(cè)其吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖6所示.經(jīng)過改進(jìn)后的標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性良好，且靈敏度高.

圖6 甲醇標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.5 精密度試驗(yàn)

取3款不同的海紅果酒，按照測(cè)定方法，重復(fù)測(cè)定3次，試驗(yàn)結(jié)果如表1所示，相對(duì)偏差較小，可滿足實(shí)驗(yàn)要求.

表1 三款海紅果酒甲醇含量測(cè)定結(jié)果

2.6 準(zhǔn)確度試驗(yàn)

用海紅果酒加標(biāo)樣做回收試驗(yàn)，加入甲醇標(biāo)準(zhǔn)使用液，使樣品中甲醇濃度增加40 mg/L，按照測(cè)定方法，重復(fù)測(cè)定3次，測(cè)定結(jié)果如表2所示，回收率在87%～93%之間，可滿足實(shí)驗(yàn)要求.

表2 海紅果酒甲醇回收率測(cè)定結(jié)果

3 結(jié)論

(1)影響甲醇標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定的主要因素有草酸-硫酸溶液的用量、無甲醇乙醇溶液中乙醇含量、顯示溫度和高錳酸鉀反應(yīng)的時(shí)間，通過調(diào)整上述各因素中物質(zhì)的用量，可提高甲醇標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定的準(zhǔn)確度和精密度.

(2)較適宜測(cè)定條件為：草酸硫酸溶液的添加量為0.6 mL，無甲醇的乙醇溶液濃度為40%，靜置時(shí)間為13 min，顯色溫度為40 ℃.在上述條件下，甲醇標(biāo)準(zhǔn)曲線的平方相關(guān)系數(shù)R2值為0.997.

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)除上述影響因素外，活性炭質(zhì)量和加入顯色劑時(shí)溶液的溫度也會(huì)對(duì)甲醇標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定產(chǎn)生一定的影響，活性炭質(zhì)量直接影響脫色效果，加入草酸-硫酸溶液時(shí)會(huì)放出大量的熱，若立即加入顯色劑，則會(huì)出現(xiàn)品紅的顏色，影響結(jié)果測(cè)定，測(cè)定時(shí)應(yīng)選取合適的活性炭和顯色劑加入時(shí)間.

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