人椎間盤髓核組織工程研究進展

張子言 佟 珅 顏華東 姜 睿 武 漢 (吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院，吉林 長春 130033)

腰痛是老年人群中的常見病和多發(fā)病，構(gòu)成了一個可觀的流行病學(xué)和經(jīng)濟學(xué)問題。盡管目前醫(yī)學(xué)的診斷及治療技術(shù)不斷進步，但隨老年人逐漸增多，發(fā)病率表現(xiàn)為上升趨勢〔1〕。腰痛造成極大的經(jīng)濟負擔(dān)，在英國每年導(dǎo)致花費120億英鎊〔2〕，美國為1 000億美元〔3〕。盡管引起腰痛的原因有許多，但是一個很明顯的原因是與椎間盤(IVD)的退變密切相關(guān)。組織工程提供了將已退變的椎間盤恢復(fù)正常功能的方法，具有光明的前景。大多數(shù)研究直接指向了髓核(NP)組織工程，因為間盤退變被認為起源于NP區(qū)域，在過去10年中，對于這個問題已取得了相當大的進展。

1 IVD的生物學(xué)

IVD的解剖包括3個部分:纖維環(huán)(AF)，NP和終板(EP)。AF、NP三明治一樣位于兩塊軟骨終板之間，使相鄰椎體成為一個整體〔4，5〕。外側(cè)AF承受張力(圓周的，軸向的和旋轉(zhuǎn)的)，NP承受壓縮力，內(nèi)側(cè)AF則受二者的混合作用〔4，5〕。這些結(jié)構(gòu)組合起來能夠承受比單一組織更大的負荷，體現(xiàn)了保持完整復(fù)合結(jié)構(gòu)的重要性。軟骨終板在維持NP細胞活性上起關(guān)鍵作用〔6，7〕，它可防止NP突出至相鄰椎體。因此這三種組織結(jié)構(gòu)對保持IVD的正常功能是十分重要的。

2 IVD的退變

IVD退變常開始于人一生中的第二個十年，隨年齡增長而發(fā)展，缺乏營養(yǎng)供應(yīng)和不適當?shù)臋C械負荷都可導(dǎo)致IVD細胞生存能力和IVD功能丟失或改變。NP基質(zhì)的破壞源自合成和退變之間的不平衡，導(dǎo)致NP區(qū)域與水結(jié)合能力降低。在病理學(xué)中，退變的NP基質(zhì)不再能夠有效的承受負荷，其結(jié)果是發(fā)生IVD退變。同時，AF良好的薄片結(jié)構(gòu)開始退化，最后發(fā)展到從內(nèi)側(cè)延伸到外圍的撕裂。

3 IVD退變的治療

目前IVD退變的治療包括非手術(shù)治療和手術(shù)治療。非手術(shù)治療包括生活方式改變(例如:降低體重，戒煙)，物理康復(fù)治療(例如:鍛煉，熱/冷刺激，電刺激，針灸和牽引)以及使用止痛藥物。當非手術(shù)方法不能緩解疼痛時，融合術(shù)仍舊是外科的標準療法〔8〕。這種治療具有巨大創(chuàng)傷，目的在于消除關(guān)節(jié)位置的活動，從而阻止疼痛。盡管臨床上經(jīng)常應(yīng)用這種療法，但是融合術(shù)常常達不到緩解疼痛的目的，還可能加速鄰近IVD的退變性改變 。全間盤人工置換術(shù)是近來應(yīng)用的一種外科治療方式，目的在于維持節(jié)段的活動性。但是，它的遠期效果尚未得到證實，人工IVD結(jié)構(gòu)的磨損對于該治療的遠期效果來說具有挑戰(zhàn)性和風(fēng)險性〔10〕，考慮到人工IVD移植手術(shù)有大量的臨床禁忌證以及有可能造成災(zāi)難性的并發(fā)癥，這一方式有效性的證實仍需長期隨訪得來的數(shù)據(jù)的支持。

4 組織工程和IVD

組織工程中3種主要的組分，包括細胞，信號和支架。信號包括生物力學(xué)因素(機械負荷)和生物化學(xué)因子(細胞活素，酶，酶抑制劑和生長因子等)，其中生長因子已得到廣泛研究〔11〕。

4.1 細胞因子 應(yīng)用細胞因子促進IVD組織細胞功能活性的再生已成為目前骨科領(lǐng)域研究的熱點，一些體內(nèi)研究也證明該觀點的有效性。

目前研究最多的與IVD退變相關(guān)的細胞因子有轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)〔12，13〕，胰島素樣生長因子 1(IGF-1)〔14〕，血小板生長因子(PDGF)〔14〕，成骨蛋白-1/骨形態(tài)蛋白-7(OP-1/BMP-7)〔13，15〕，BMP-2 和 BMP-12〔16，17〕，以及近幾年成為研究熱點的GDF-5〔18～20〕。

GDF-5〔21〕被認為是軟骨形態(tài)蛋白-1(CDMP-1)和 BMP-14，是GDF家族的一員，與骨形態(tài)蛋白緊密相關(guān)。GDF-5主要的作用是刺激基質(zhì)產(chǎn)生和IVD細胞的增殖。Walsh等〔22〕使用靜態(tài)壓力誘導(dǎo)了鼠尾間盤的退變，隨后研究了體內(nèi)不同生長因子的治療作用。單獨注射GDF-5明顯刺激了IVD高度的增加，但是IGF-1、TGF-β 或 bFGF 沒有這種效應(yīng)。Masuda等〔15〕發(fā)現(xiàn) rhGDF-5在牛的NP和AF細胞中，能夠增加細胞的繁殖和基質(zhì)的合成，NP細胞比AF細胞的應(yīng)答效應(yīng)更加明顯。他們還報道了在兔間盤退變模型中，向NP區(qū)域注射rhGDF-5誘導(dǎo)了間盤高度的恢復(fù)和改善，并由組織學(xué)和MRI分析所證實。最新的證據(jù)顯示〔18〕，GDF-5療法能夠改進NP細胞的成軟骨細胞特征。

參與分解代謝的細胞因子有 IL-1、神經(jīng)生長因子(NGF)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)以及金屬基質(zhì)蛋白酶(MMPs)等，可促進Ⅱ型膠原和蛋白多糖的降解。無論是體外細胞培養(yǎng)還是體內(nèi)動物實驗，都發(fā)現(xiàn) MMPs(MMP-1，3，9，10)普遍存在于退變的IVD中，并且含量較高，提示其參與細胞外基質(zhì)(ECM)的降解〔23，24〕。

4.2 細胞 NP細胞主要為脊索殘留細胞，隨著個體的發(fā)育成熟而逐漸消失，最終被軟骨樣細胞所替代。在動物模型中IVD的退行性變均在脊索源性細胞消失后才出現(xiàn)，盡管人類發(fā)育高峰期稍推后，但脊索源性細胞的消失和IVD退行性變間確實存在著某種密切關(guān)聯(lián)，有待進一步的研究〔25〕。理論上，延緩NP退變需要移植同源自體NP細胞，但是很難想象能夠從需要替代的退變組織中獲取健康細胞。同樣，從技術(shù)上和倫理學(xué)角度上獲取健康人類的NP細胞是困難的，因為大多數(shù)IVD手術(shù)中切除的是已退變的NP。近來，永生化的人類NP細胞系已被研究出來，考慮可用于臨床應(yīng)用〔26〕。為了修復(fù)退變NP組織的基質(zhì)，移植的細胞必須產(chǎn)生大量的蛋白聚糖(例如聚集蛋白多糖)，膠原蛋白和其他基質(zhì)蛋白。軟骨細胞和來自IVD中央?yún)^(qū)域的細胞通常產(chǎn)生這些基質(zhì)蛋白，這使得他們可作為IVD修復(fù)的候選細胞。目前可供選擇的種子細胞包括捐獻的異體間盤細胞、自體軟骨細胞和干細胞。間充質(zhì)干細胞(MSC)同樣被認為是一種活躍的，對 NP 退變的潛在的治療選擇〔14，27～30〕。而且，過去10年中對干細胞研究的進展，顯示將成人MSCs用于NP 組織工程是很有前景的〔11，21，31～35〕。MSCs 的最初研究由Friedenstein和他的同事完成，已超過了40年。目前已被廣泛認可，MSCs有分化為不同間葉起源細胞系的能力，包括軟骨細胞、成骨細胞和脂肪細胞系，分化結(jié)果取決于不同的生物學(xué)環(huán)境，能夠獲得多種成人組織，例如骨髓、骨小梁、關(guān)節(jié)軟骨、肌肉和脂肪。

脂肪干細胞(ADSC)在骨和軟骨修復(fù)中作為一種細胞資源已得到密切關(guān)注〔13〕。尤其，在最近的研究中，在NP組織退變中應(yīng)用 ADSCs，研究結(jié)果令人備受鼓舞〔20，36〕。Lu 等〔37〕報道了將人類ADSCs和NP細胞以微塊方式共培養(yǎng)，導(dǎo)致ADSCs向類NP細胞表現(xiàn)型方向分化。Tapp等〔20〕透露在三維培養(yǎng)的沙鼠ADSCs用TGF-b處理或與人類IVD細胞共培養(yǎng)都可以明顯刺激蛋白聚糖和Ⅰ型膠原表達。Gaetani等〔36〕呈現(xiàn)的數(shù)據(jù)提示在基質(zhì)合成和三維細胞組織中，人類NP細胞和ADSCs共培養(yǎng)能增加體外重構(gòu)組織的質(zhì)量。另一方面，細胞擴增的基本要求是達到移植的有效細胞數(shù)量，傳統(tǒng)單層細胞培養(yǎng)方式存在一些不足，包括細胞的分化、衰老和基因突變〔33〕。ADSC的一大優(yōu)點是可以在門診病人身上通過微創(chuàng)方式輕易獲取脂肪組織，周圍組織ADSCs的含量可達到25 000/g。Minogue等〔38〕發(fā)現(xiàn)盡管MSCs和ADSCs都可以分化為NP細胞，但相對于MSCs而言，ADSC向NP分化的細胞表型與NP細胞相似性更高，因此更適合于NP組織工程。因此，在臨床應(yīng)用中，脂肪組織可以被認為是干細胞的合適來源，在獲得程序上簡易，細胞數(shù)量上達標。

4.3 NP的支架 當設(shè)計一個用于組織工程的支架時，需要考慮到許多因素，例如免疫原性、結(jié)構(gòu)性和力學(xué)性能，生物相容性和生物降解性以及采用何種移植方法〔17〕，理想的組織工程支架材料應(yīng)具備以下條件〔39〕:良好的組織相容性;具有可塑性，并有一定的機械強度;具有三維立體結(jié)構(gòu)，一方面有利于細胞的植入黏附，另一方面有利于營養(yǎng)成分的滲入和細胞代謝產(chǎn)物的排出;此外，還應(yīng)該具有較好的生物可降解性，在組織形成過程中逐漸分解，不影響新形成組織的結(jié)構(gòu)和功能。目前已報道的有貝殼或羥基磷灰石貝殼、褐藻膠、蛋白聚糖/端膠原凝膠、透明質(zhì)酸、磷酸鈣、聚左旋-乳膠(PDLA)、去礦化骨基質(zhì)(DBM)和小腸黏膜下層(SIS)〔11〕等。

隨著微創(chuàng)手術(shù)的不斷發(fā)展，在手術(shù)治療以后應(yīng)用注射型支架來增加NP組織含量已應(yīng)用多年。自1974年硅膠第一次應(yīng)用于IVD置換以來，已經(jīng)發(fā)展出了很多注射用的生物材料，例如透明質(zhì)酸，纖維蛋白，類彈性蛋白多肽，Ⅰ型膠原蛋白，Ⅱ型膠原蛋白褐藻膠和殼聚糖〔40，41〕。

殼聚糖，起源于部分解聚和去乙酰膽堿的殼質(zhì)，是甲殼綱動物殼的主要組分，具有突出的生物學(xué)性能，如組織相容性，生物退變性和抗細菌活性。這些性能與它特殊的物理和化學(xué)組成相一致，使它成為骨科組織工程中一種多功能的生物高分子聚合物〔42〕。尤其是，作為一種凝膠制劑，它能夠形成轉(zhuǎn)換pH或溫度的凝膠。已證實帶有甘油磷酸或磷酸氫銨(AHP)的殼聚糖的組合能夠產(chǎn)生一種熱感應(yīng)凝膠，在室溫下是液體，在生理溫度下為固體〔43，44〕。這種性能能夠使殼聚糖凝膠用來IVD內(nèi)注射。凝膠被推薦為一種理想的用來NP置換的候選支架材料，因為它們與天然組織機械性能相近〔45〕。目前已有兩項研究提供了使用殼聚糖/甘油磷酸凝膠作為支架的證據(jù)，文獻顯示它們能維持牛的NP細胞的生存能力和功能〔46〕，進而在不同的培養(yǎng)基中〔47〕誘導(dǎo)人類MSCs向類NP細胞分化。

組織工程為NP退變的治療提供了一個新的途徑，這一技術(shù)已在臨床治療軟骨損傷中得到應(yīng)用。一般通過兩種途徑實現(xiàn):(1)分離IVD細胞種植于基質(zhì)，體外生長以達到需要的組分，然后移植到退變IVD中。(2)使用可降解的高分子聚合物附加于細胞上，將混合有高分子聚合物的細胞注射入IVD，在IVD中原位增殖〔48〕。NP再生的臨床研究中顯示，使用自體同源的IVD軟骨細胞移植(ADCT)能明顯減輕疼痛，尋找適合的載體將增強這一方法的治療潛力〔49〕。因此，研究注射型支架是十分必要的。一些研究者已對NP細胞體外培養(yǎng)的培養(yǎng)環(huán)境和支架進行了大量研究。

自體同源軟骨細胞移植法(ACT)用于治療軟骨疾病是一種越來越流行的方法。Gorensek等〔50〕將新西蘭大白兔的NP從IVD中移出，替代以耳部軟骨來源的軟骨細胞。他們的研究顯示耳部軟骨來源的ACT能移植替代NP。Mizuno等〔51〕嘗試重構(gòu)混合性IVD結(jié)構(gòu)，包含種植于PGA的AF和NP細胞，各自帶有海藻支架，樣本移植于無胸腺大鼠皮下。他們的研究顯示，在臨床應(yīng)用中，創(chuàng)造一個帶有與天然組織類似組成和力學(xué)性能的混合型IVD是可行的。

Hamilton等〔52〕研究了體外重建IVD三維結(jié)構(gòu)的可能性，它包含NP和軟骨終板和帶孔鈣磷酸鹽替代性骨。牛關(guān)節(jié)軟骨種植于帶孔鈣磷酸鹽的表面，允許體外培養(yǎng)形成軟骨和NP細胞放置于體外培養(yǎng)形成的透明軟骨之上。它們的研究顯示了生成復(fù)合結(jié)構(gòu)的可能性，包含類終板軟骨層，從而使替代IVD的骨組織界面間特性變得更好。IVD的組織工程使用MSCs誘導(dǎo)分化為IVD細胞表型，這已被認為是IVD退變治療的可供選擇之一。

成功的組織工程NP移植應(yīng)該具有近似天然組織的功能。由于目前缺乏關(guān)于它們生物學(xué)表型的足夠知識，NP細胞的特征仍需進一步明確。特定的細胞標記物如CD24、缺氧誘導(dǎo)因子-1(HIF-1)、葡萄糖輸送因子-1(GLUT-1)、MMP-2、雕刻蛋白3(GPC3)和角蛋白 19(K19)被認為是有益的參考〔35，53～55〕，尤其是Risbud等〔35〕認為HIF-1α能作為髓核細胞的表型標記物，從而用于鑒定髓核細胞。

5 展望

NP組織工程提供了治療人IVD退變的美好前景。但是，距離臨床應(yīng)用仍很遙遠。至今大部分體內(nèi)實驗數(shù)據(jù)都是從鼠和犬類模型獲得的。但在這些動物IVD內(nèi)存在脊索細胞，有可能轉(zhuǎn)變成NP細胞，而人類脊索細胞僅存在于胚胎期并且出生后很快消失，這在很大程度上限制了實驗數(shù)據(jù)的應(yīng)用。盡管體外動物實驗種類較多，但是由于動物退變模型的營養(yǎng)情況好于人類 IVD，兩者退變過程不一致，造模還是不能精確模擬人類IVD退變的過程，從而影響對退變機制的認知。

應(yīng)用組織工程學(xué)方法，對退變NP進行干預(yù)，是為了延緩或逆轉(zhuǎn)IVD退變，目前還處于研究的初期階段。IVD中心區(qū)域無血供，營養(yǎng)差，移植的細胞存活問題較為突出，而注射到退變IVD內(nèi)的細胞因子也不易發(fā)揮有效作用，因此如何解決退變IVD的營養(yǎng)供應(yīng)有待于進一步研究。

通過組織工程學(xué)的方法，有機結(jié)合細胞移植、細胞因子及(或)轉(zhuǎn)基因技術(shù)復(fù)合支架植入病變NP，修復(fù)甚至重塑NP，改善細胞外基質(zhì)營養(yǎng)成分，增加NP含水量，恢復(fù)變窄、塌陷腰椎間隙，修復(fù)受損的纖維環(huán)裂口，改善軟骨終板的營養(yǎng)供應(yīng)，是NP組織工程研究的價值所在。

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