浙江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院 王 月 楊彬彬 邵慶均
在集約化程度不斷提高的現(xiàn)代養(yǎng)殖模式下,營(yíng)養(yǎng)缺陷、環(huán)境因素等易誘導(dǎo)水產(chǎn)動(dòng)物發(fā)生疾病,并且一旦發(fā)病嚴(yán)重,極易以水生環(huán)境為媒介發(fā)生大規(guī)模的傳播和感染,引起水產(chǎn)動(dòng)物大量死亡。因此,水產(chǎn)動(dòng)物疾病的預(yù)防工作成為水產(chǎn)養(yǎng)殖中極為重要的環(huán)節(jié)。從營(yíng)養(yǎng)調(diào)控的角度增強(qiáng)水產(chǎn)動(dòng)物的免疫能力成為防控水產(chǎn)動(dòng)物疾病的研究熱點(diǎn)。甲殼素和殼聚糖作為飼料添加劑,在調(diào)節(jié)水產(chǎn)動(dòng)物的免疫功能、提高抗病能力等方面效果明顯。
甲殼素,又稱幾丁質(zhì),是一種天然黏多糖,廣泛存在于甲殼動(dòng)物、昆蟲的外殼及真菌、藻類的細(xì)胞壁中,自然界中其產(chǎn)量?jī)H次于纖維素。天然甲殼素是聚2-乙酰氨基-2-脫氧-D-吡喃葡萄糖以1,4糖苷鍵連接而成的無分支的線形高分子聚合物。甲殼素是除蛋白質(zhì)外數(shù)量最大的含氮天然有機(jī)化合物。甲殼素可以被溶菌酶、幾丁質(zhì)酶降解,具有較低的免疫原性,而生物相容性和生物降解性較好。甲殼素與纖維素結(jié)構(gòu)十分相似,不溶于水和大多數(shù)有機(jī)溶劑,化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定(Ravi Kumar,2000)。
通常情況下,甲殼素在堿性條件下進(jìn)行乙?;幚淼漠a(chǎn)物是殼聚糖。自然界中的多聚糖一般為酸性或中性,而殼聚糖是自然界中少有的堿性高聚物。因此,較易形成多氧鹽、螯合金屬離子等。程珊珊等(2011)研究報(bào)道,殼聚糖對(duì)水體中鎘離子(Cd2+)和鉛離子(Pb2+)具有較強(qiáng)的吸附作用。
有研究認(rèn)為,甲殼素及殼聚糖可以刺激機(jī)體的非特異性免疫,提高機(jī)體抵抗細(xì)菌及病毒的能力,并且具有抗腫瘤細(xì)胞的活性 (Nishimura等,1984)。
甲殼素和殼聚糖可以活化巨噬細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞來表達(dá)一些引起發(fā)炎反應(yīng)的細(xì)胞因子,如白介素-1、集落刺激因子和γ干擾素等(Lee等,2008)。并且有研究還發(fā)現(xiàn),甲殼素和殼聚糖的混合程度對(duì)其發(fā)揮免疫促進(jìn)劑的作用有關(guān),由30%甲殼素和70%殼聚糖混合后產(chǎn)生的活化巨噬細(xì)胞的作用比單純的甲殼素或殼聚糖的作用效果更佳(Iida等,1987)。有的研究則報(bào)道,在抵抗念珠菌感染上,甲殼素促進(jìn)免疫的作用與給予的劑量有關(guān)。
近年來也有試驗(yàn)表明,天然甲殼素因分子質(zhì)量巨大、聚合度高而未表現(xiàn)出顯著提高機(jī)體免疫指標(biāo)的作用,相比之下,經(jīng)過處理后分子量較小的殼聚糖或甲殼素片段則在增強(qiáng)免疫方面有著較強(qiáng)的作用。Shibata等(1997)首先在小鼠上用細(xì)小的甲殼素顆粒(1~10 μm)進(jìn)行靜脈注射,發(fā)現(xiàn)小片段的甲殼素可以活化肺泡巨噬細(xì)胞以表達(dá)如白介素-12、腫瘤壞死因子(TNF)-α 和白介素-18,并刺激自然殺傷細(xì)胞分泌干擾素INF-γ。并且進(jìn)一步證明了這些細(xì)胞因子的產(chǎn)生是基于一種依賴甘露糖受體的細(xì)胞吞噬作用途徑。甲殼素顆粒在甘露糖受體的協(xié)助作用下完成吞噬細(xì)胞的內(nèi)化作用,再由巨噬細(xì)胞溶菌酶和N-乙酰-β-氨基葡糖苷酶降解。
Reese等(2007)在研究甲殼素體內(nèi)促免疫作用時(shí),將甲殼素和殼聚糖顆粒由表達(dá)綠色熒光蛋白標(biāo)記的白介素-4的小鼠鼻腔直接注入肺部,結(jié)果發(fā)現(xiàn),幾小時(shí)后一些分泌白介素-4的免疫細(xì)胞,尤其是嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞在肺部被大量募集。表明甲殼素可以活化一些非特異性免疫細(xì)胞,引起過敏類的發(fā)炎反應(yīng)。
目前,針對(duì)甲殼素及殼聚糖對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物免疫功能的影響上研究報(bào)道較多,絕大多數(shù)是關(guān)于甲殼素及殼聚糖對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物非特異性免疫系統(tǒng)的影響,而很少涉及其對(duì)特異性免疫系統(tǒng)的作用。這可能與目前對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物特異性免疫系統(tǒng)的研究并不十分深入有關(guān)。近年來,隨著虹鱒甲殼素結(jié)合蛋白的發(fā)現(xiàn),關(guān)于甲殼素對(duì)魚體免疫作用的研究進(jìn)一步深入(Rusell等,2008)。甲殼素結(jié)合蛋白存在于虹鱒的鰓、脾臟、肝竇、腎間質(zhì)腸、皮膚、魚鰾以及白細(xì)胞內(nèi)部。這種蛋白質(zhì)與人和嚙齒類的一種血漿凝集素屬于同源蛋白。Schlosser等(2009)在小鼠體內(nèi)也發(fā)現(xiàn)了一種甲殼素受體蛋白,這種甲殼素受體蛋白是一種由FIBCD1基因表達(dá)的同源四聚體跨膜蛋白,在包括魚類的脊椎動(dòng)物中結(jié)構(gòu)比較保守,并在消化道中高度表達(dá)。這種受體通過一種與乙?;募讱に鼗蚣讱に仄胃哂H和性的鈣依賴性途徑參與到細(xì)胞內(nèi)吞作用中。
3.1 海水魚類 Esteban等(2000)用直徑小于10 μm的甲殼素顆粒對(duì)金頭鯛(Sparus aurata L.)進(jìn)行靜脈注射和腹腔注射,發(fā)現(xiàn)經(jīng)腹腔注射的金頭鯛其體液免疫和細(xì)胞免疫指標(biāo)均顯著提高。天然補(bǔ)體溶血活性在注射5 d后提高,但沒有達(dá)到顯著水平;呼吸爆發(fā)和吞噬細(xì)胞吞噬能力分別在3 d和5 d后達(dá)到峰值;細(xì)胞毒素活性在3 d后顯著提高并一直持續(xù)至注射后10 d。而靜脈注射對(duì)金頭鯛的各項(xiàng)免疫指標(biāo)均未產(chǎn)生顯著影響。Esteban(2001)用甲殼素添加水平分別為25、50 mg/kg和100 mg/kg的飼料飼喂初重為(125±13)g的金頭鯛,分別在第2、4、6周測(cè)定其各項(xiàng)非特異性免疫指標(biāo),結(jié)果發(fā)現(xiàn),飼喂水平為25 mg/kg和50 mg/kg的金頭鯛非特異性免疫得到顯著提高;天然補(bǔ)體溶血活性和細(xì)胞毒素活性在飼喂2周后顯著提高,呼吸爆發(fā)和吞噬細(xì)胞吞噬能力分別在飼喂甲殼素4周和6周后顯著提高;而溶菌酶活性和生長(zhǎng)性能則沒有受到顯著影響。試驗(yàn)結(jié)果表明,適量的甲殼素可以提高魚體免疫功能,而添加量過高則可能不會(huì)起到提高免疫功能的作用。并且甲殼素對(duì)不同免疫指標(biāo)的影響具有時(shí)間差異。Cuesta和Esteban(2003)研究進(jìn)一步證明,甲殼素顆粒的大小對(duì)免疫細(xì)胞的吞噬能力也有影響。用含有不同大小的甲殼素顆粒的培養(yǎng)液培養(yǎng)金頭鯛的白細(xì)胞,結(jié)果發(fā)現(xiàn),白細(xì)胞只能吞噬直徑小于10 μm的甲殼素顆粒,并在培養(yǎng)1~4 h后白細(xì)胞的吞噬能力得到提高,但其呼吸爆發(fā)未受到顯著影響。金頭鯛白細(xì)胞吞噬甲殼素顆粒很可能是通過甘露糖/巖藻糖受體途徑,這種受體主要識(shí)別含氨基或亞氨基的抗原并激發(fā)白細(xì)胞的一系列免疫反應(yīng),目前僅在哺乳動(dòng)物和金頭鯛中發(fā)現(xiàn),而在其他魚類中尚未見報(bào)道(Cuesta 和 Esteban,2003)。
3.2 淡水魚類 Choudhury等 (2005)給初重為(13.40±0.17) g 的露斯塔野鯪(Labeo rohita L.)飼喂甲殼素添加水平為25 mg/kg和50 mg/kg的飼料,15 d后發(fā)現(xiàn),對(duì)露斯塔野鯪的增重率、特定生長(zhǎng)率、飼料效率、蛋白質(zhì)效率等均無顯著影響,也未顯著提高試驗(yàn)魚的白細(xì)胞數(shù)量、呼吸爆發(fā)等免疫指標(biāo)。用嗜水氣單孢菌(Aeromonas hydrophila)進(jìn)行攻毒試驗(yàn)后,飼喂甲殼素的試驗(yàn)魚存活率未得到顯著提高。這可能與甲殼素添加水平過低不足以起到免疫增強(qiáng)劑的作用有關(guān)。Gopalakannan和 Arul(2006)試驗(yàn)證明,鯉魚(Cyprinus carpio)在飼喂1%甲殼素或殼聚糖后,其溶菌酶活性和利用NBT法測(cè)得鯉魚嗜中性粒細(xì)胞呼吸爆發(fā)在飼喂30 d后達(dá)到峰值,并且飼喂殼聚糖組的溶菌酶活性約是飼喂甲殼素組的2倍,峰值過后雖一定程度下降但仍顯著高于對(duì)照(P<0.001)。45 d和90 d后用分別用嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)進(jìn)行攻毒試驗(yàn),發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)45 d后飼喂甲殼素和殼聚糖組的相對(duì)成活率分別是40%和80%,而90 d后分別降低到37.5%和68.9%。相對(duì)成活率是反映免疫促進(jìn)劑或疫苗有效性的指標(biāo),一般大于50%即可視為有效提高免疫。試驗(yàn)結(jié)果表明,一定濃度的殼聚糖可以提高鯉魚的非特異性免疫功能,并且作用效果優(yōu)于甲殼素。華雪銘等(2007)研究了飼料中添加殼聚糖對(duì)暗紋東方鲀(Fugu obscurus)抗病力和免疫功能的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),用添加了0.2%、0.5%、1.0%的殼聚糖的基礎(chǔ)飼料投喂平均體重為(3.15±0.05)g暗紋東方鲀 2個(gè)月后,脾臟自然殺傷細(xì)胞的殺傷活性顯著提高;試驗(yàn)魚的頭腎B淋巴細(xì)胞體外培養(yǎng)時(shí)分泌的IgM顯著增加。陳勇等(2010)以含0.50%殼聚糖A(分子量較?。┖?.50%殼聚糖B(分子量較大)的基礎(chǔ)飼料分別投喂2齡異育銀鯽 (Carassius auratus gibelio),64 d后發(fā)現(xiàn),兩種殼聚糖均可顯著提高異育銀鯽外周血淋巴細(xì)胞數(shù)量、白細(xì)胞吞噬活性和脾臟溶菌酶活性(P<0.05),顯著降低外周血多形核細(xì)胞數(shù)量(P<0.05),并且殼聚糖A能夠顯著提高異育銀鯽脾臟B淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力;同時(shí)顯著提高異育銀鯽血清中T3的含量 (P<0.05),顯著降低異育銀鯽血清中皮質(zhì)醇和T4淋巴細(xì)胞的含量(P<0.05)。試驗(yàn)結(jié)果表明,殼聚糖通過提高血清T3水平、降低血清皮質(zhì)醇水平增強(qiáng)異育銀鯽的非特異免疫功能。并且,試驗(yàn)也驗(yàn)證了殼聚糖分子量的大小可能影響其對(duì)魚類細(xì)胞免疫的作用,分子量較小的殼聚糖具有更好的增強(qiáng)免疫的效果。翟少偉和劉淑蘭(2011)與賈景濤等(2012)分別試驗(yàn)研究了水體中添加殼聚糖后對(duì)水環(huán)境鎘或鋅致羅非魚(Oreochromis Niloticus)急性中毒的影響。結(jié)果表明,養(yǎng)殖水體中加入一定濃度的殼聚糖對(duì)鎘或鋅致羅非魚急性毒性有顯著改善作用,試驗(yàn)組魚的病死率顯著低于對(duì)照組。這可能與殼聚糖可以螯合水體中重金屬離子的功能有關(guān)。
3.3 甲殼類 Powell和 Rowley(2007)在普通濱蟹(Carcinus maenas)的餌料中添加了 5%和10%的甲殼素,結(jié)果發(fā)現(xiàn),試驗(yàn)組蟹成活率顯著提高,但非特異性免疫指標(biāo)并無顯著改善,而肝胰臟和血淋巴中細(xì)菌總數(shù)顯著低于對(duì)照組。這可能與甲殼素的添加改善了試驗(yàn)蟹的消化道微生物群系有關(guān)。Wang 和 Chen(2005)用 4、6、8 μg/g 的甲殼素和 2、4、6 μg/g 殼聚糖分別注射均重 (10.4±0.7) g凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeus vannamei)的頭胸部腹側(cè)竇后,用溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)進(jìn)行攻毒試驗(yàn),6 d后發(fā)現(xiàn),注射過甲殼素或殼聚糖組的試驗(yàn)蝦成活率顯著高于對(duì)照組,并發(fā)現(xiàn)注射6 μg/g甲殼素和4、6 μg/g殼聚糖的試驗(yàn)蝦其血細(xì)胞總數(shù)和呼吸爆發(fā)在2 d后顯著提高,酚氧化酶活性在注射6 d后一直保持較高水平。Zhu等(2010)用添加水平分別為5、10 mg/g和15 mg/g甲殼素或殼聚糖的飼料飼喂初重為20 g左右的克氏原螯蝦(Procambarus clarkia),4周后用感染了白斑綜合征病毒(White spot syndrome virus,WSSV)的克氏原螯蝦尾部肌肉飼喂試驗(yàn)蝦進(jìn)行攻毒試驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),10 mg/g殼聚糖飼喂組累積死亡率顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。各試驗(yàn)組克氏原螯蝦的血細(xì)胞總數(shù)、原酚氧化酶活性和雙氧化物歧化酶活性(SOD)等免疫指標(biāo)均顯著提高。并且飼喂殼聚糖的試驗(yàn)組蝦各項(xiàng)指標(biāo)均顯著高于飼喂甲殼素的試驗(yàn)組。
另外,也有研究證明,甲殼素或殼聚糖對(duì)某些水產(chǎn)動(dòng)物的免疫功能無顯著的改善作用。Lin等(2011)用添加了0.2%殼聚糖的飼料飼喂錦鯉(Cyprinus carpio koi),56 d 后發(fā)現(xiàn),無論是白細(xì)胞總數(shù),還是非特異性免疫的體液免疫、細(xì)胞免疫指標(biāo)均未發(fā)生顯著變化。
綜上所述,大量試驗(yàn)研究表明,適量添加甲殼素或殼聚糖可以增強(qiáng)水產(chǎn)動(dòng)物的非特異性免疫功能、提高水產(chǎn)動(dòng)物抵抗和防御病原微生物感染的能力。但是,目前為止對(duì)甲殼素和殼聚糖對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物的作用機(jī)理研究并不深入,因此可以借鑒其在小鼠等哺乳動(dòng)物中的研究成果,為甲殼素和殼聚糖在水產(chǎn)動(dòng)物中的研究提供引導(dǎo)和方向。
今后應(yīng)針對(duì)以下問題進(jìn)行深入研究:(1)進(jìn)一步明確甲殼素和殼聚糖的作用機(jī)制和影響因素。(2)深入了解添加方式、給予途徑、添加水平和顆粒大小對(duì)甲殼素和殼聚糖作用的影響,針對(duì)不同水產(chǎn)品種摸索最佳添加水平。(3)開展甲殼素、殼聚糖與其他免疫增強(qiáng)劑或飼料添加劑的協(xié)同作用研究。(4)在國(guó)內(nèi)更多名貴養(yǎng)殖品種上展開研究。(5)探討甲殼素的其他衍生物,如稀土甲殼素、殼聚寡糖對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物免疫功能的影響作用。
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