衛(wèi)氏并殖吸蟲二、三倍體型的比較研究

柳建發(fā)，張劼楠，蔣雯雯

2.寧波市疾病預(yù)防控制中心，浙江 315010

并殖吸蟲病是一種重要的人獸共患病，流行于亞洲、非洲和美洲25個國家。在全球報告的50個種群中，衛(wèi)氏并殖吸蟲發(fā)現(xiàn)早，分布廣泛，而且其是人體的最主要的致病蟲種，故普遍引以關(guān)注。從其發(fā)現(xiàn)起至今，已經(jīng)百余年，但有關(guān)蟲種問題尚不一致。其中，上個世紀(jì)70年代，日本學(xué)者對并殖吸蟲檢測時，發(fā)現(xiàn)衛(wèi)氏并殖吸蟲存在二、三倍體（2n＝22，3n＝33）兩種類型，經(jīng)著名寄生蟲學(xué)家Miyazaki（宮崎一郎）收集全球標(biāo)本檢測比較，發(fā)現(xiàn)這兩型雖然在囊蚴、蟲體和蟲卵形態(tài)上極為相似，只是在大小上差別明顯，加上二倍體型蟲體具精子，三倍體型無；二倍體型行交配生殖，而三倍體型為孤雌生殖；對人體致病性也存在三倍體型明顯強(qiáng)于二倍體型；在數(shù)量上二倍體型廣泛分布，而三倍體型僅發(fā)現(xiàn)于日本、韓國、中國的臺灣、東北、安徽、浙江和福建。因此，Miyazaki將二倍體型定名為衛(wèi)氏并殖吸蟲（P.westermani）；將三倍體型定為肺生并殖吸蟲（P.pulmonalis）［1］。

研究并殖吸蟲的種間和種內(nèi)遺傳差異，通常是通過ITS2和部分COI的DNA序列分析。這是利用不同基因的進(jìn)化速率不同，分析不同階元的種系發(fā)生。COI基因?qū)倬€粒體基因組，而ITS2基因?qū)儆诤嘶蚪M。由于前者的進(jìn)化速率較核基因組快，并且是以母系遺傳為主，基本不受基因重組的影響，適用于種內(nèi)遺傳差異的研究；而ITS2基因相對保守，適用于并殖吸蟲種間差異的研究［2］。本文謹(jǐn)對衛(wèi)氏并殖吸蟲二、三倍體型的比較研究展開綜述。

1 形態(tài)差異

衛(wèi)氏并殖吸蟲二、三倍體型在形態(tài)上有著明顯差別。觀察兩型精子發(fā)生過程的超微結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，二倍體型精子發(fā)生過程正常，各發(fā)育階段細(xì)胞的活性均較強(qiáng)，最后可形成大量形態(tài)與功能正常的精子。而三倍體型卻不能產(chǎn)生正常的精子，其原因是精子發(fā)生退化畸形，即細(xì)胞間橋過早斷裂，細(xì)胞分裂異常，產(chǎn)生合胞體，次級精母細(xì)胞的第二次成熟分裂沒有發(fā)生，細(xì)胞器稀少且發(fā)育不良，導(dǎo)致細(xì)胞活性降低，最后引起細(xì)胞分化異常［3］。

兩型成蟲之間除受精囊內(nèi)有無精子是其主要特征外，在大小及其他形態(tài)結(jié)構(gòu)上并無明顯區(qū)別。成蟲的大小不能作為兩型鑒別的依據(jù)。兩型間囊蚴的區(qū)別主要體現(xiàn)在其形體大小上，大型者為三倍體型，小型者為二倍體型。兩型間蟲卵的差別最為顯著。三倍體型蟲卵外形為長橢圓型，前端寬而末端窄，最大寬度約位于蟲卵前1/3處，二倍體型蟲卵為卵圓形，兩端鈍圓，或上窄下寬，最大寬度約位于蟲卵的中部。兩型蟲卵的卵小蓋亦有顯著不同，其寬度與高度經(jīng)顯著性檢驗(yàn)差別有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。三倍體型的卵小蓋寬而高，二倍體型的卵小蓋較窄而低平。因此作者提出以患者咳痰中的蟲卵類型來鑒別衛(wèi)氏并殖吸蟲的類型［4］。另據(jù)報道，衛(wèi)氏并殖吸蟲還存在一種嵌合體型，成蟲生殖細(xì)胞的染色體數(shù)為22/33，蟲卵大小介于二、三倍體型之間，并發(fā)現(xiàn)在動物體內(nèi)三種類型自然混合寄生［5］。不同倍體的衛(wèi)氏并殖吸蟲可能增加致病性，也可能與中間宿主和終宿主有關(guān)［6］。

2 蛋白差異

蛋白質(zhì)是表達(dá)遺傳信息的一種方式，分析衛(wèi)氏并殖吸蟲兩型的蛋白質(zhì)成分能夠輔助證明二者之間的親緣關(guān)系。應(yīng)用等電點(diǎn)聚焦電泳方法分析兩型成蟲、童蟲的普通蛋白和糖蛋白成分，發(fā)現(xiàn)兩型之間的帶型分布、等電點(diǎn)和著色濃度基本相同。童蟲與成蟲比較，帶型分布和著色濃度基本一致，但帶數(shù)不同［7］。進(jìn)一步測定兩型的氨基酸含量可知，兩型成蟲體內(nèi)均含有17種相同的氨基酸，但氨基酸含量差別較大［8］。童蟲中二倍體型檢出15種，三倍體型檢出16種氨基酸。囊蚴中二倍體型檢出11種，三倍體型檢出15種氨基酸。在童蟲和囊蚴間，三倍體型比二倍體型的氨基酸種類多而且含量高?？梢娊M成成蟲蟲體的結(jié)構(gòu)蛋白大多在童蟲階段已經(jīng)合成，氨基酸的不同導(dǎo)致兩型之間蛋白質(zhì)有所差異。但是差異并不明顯，兩型之間蛋白質(zhì)存在高度同源性，SDS－PAG結(jié)果表明，兩型蟲株的結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)均具有基本相同的分子量。

3 同工酶差異

同工酶是由單細(xì)胞階段的一個前體酶譜產(chǎn)生的，它的一系列復(fù)雜變化隨著個體的發(fā)育而發(fā)生。同工酶分析結(jié)果可表現(xiàn)種特征性酶譜，對并殖吸蟲蟲種鑒定具有重要意義。研究兩型衛(wèi)氏并殖吸蟲間EST、MDH、LDH三種酶系統(tǒng)的同工酶譜發(fā)現(xiàn)，EST同工酶譜的相似系數(shù)最大，且主帶較近似，而MDH、LDH同工酶譜的差異較為明顯，主要表現(xiàn)在LDH同工酶的帶數(shù)、主帶的位置及雙帶出現(xiàn)的位置不同和MDH主帶的數(shù)目、Rf值、染色強(qiáng)度和弱帶的數(shù)目不同［9］。進(jìn)一步對二、三倍體型的9種同工酶分析結(jié)果表明兩者酶蛋白分子存在明顯的同源性。G－6－PDH、DIA、PO、TO、和ACP 5種同工酶在兩型的所有受檢個體中均表現(xiàn)一致的電泳譜，PGM和MDH呈現(xiàn)多態(tài)性，分別可見3種表現(xiàn)型。HK和ME在二倍體型中出現(xiàn)個別酶變異體。比較分析兩型吸蟲在不同發(fā)育期之間及相應(yīng)各發(fā)育期之間同工酶譜發(fā)現(xiàn)ALD、HK、G6PD均存在變異。變異表現(xiàn)為兩種方式，一種是在同一個基因座位區(qū)的同工酶的酶帶數(shù)目、遷移位置及活性發(fā)生變異；另一種是兩型吸蟲在有的發(fā)育期整個基因座位區(qū)無酶帶顯示。這反映了兩型吸蟲在發(fā)育進(jìn)程中編碼同工酶的基因遺傳背景的差異。不同地區(qū)的二倍體型衛(wèi)氏并殖吸蟲的EST、MDH、LDH、ALP 4種同工酶，總體上呈多態(tài)現(xiàn)象，酶譜顯示出一定的差異［10］。通過酶電泳分析可認(rèn)為三倍體來源于兩個不同亞種或親緣關(guān)系相近的兩個種雜交。

4 抗原差異

兩型衛(wèi)氏并殖吸蟲在宿主體內(nèi)寄生狀況及致病性存在明顯差異，這被歸因于兩者對人的寄生適應(yīng)性不同。影響寄生蟲對宿主寄生適應(yīng)性的因素很復(fù)雜，但首先被考慮到的是寄生蟲的免疫逃避現(xiàn)象，它主要涉及蟲體抗原的變異和宿主的應(yīng)答狀態(tài)。使用間接兔疫熒光杭體法，對鼠體內(nèi)兩種類型衛(wèi)氏并殖吸蟲蟲體杭原與宿主杭原做了檢測。結(jié)果顯示兩類型童蟲與感染同源衛(wèi)氏并殖吸蟲小鼠血清反應(yīng)后，蟲體杭原存在于體表皮層、腸管上皮細(xì)胞上。兩類型童蟲與兔抗鼠紅細(xì)胞杭體血清反應(yīng)后，主要在表皮層看到宿主抗原，熒光強(qiáng)度比蟲體抗原所示為弱。不論宿主是否處于免疫狀態(tài)，所獲兩型童蟲都能結(jié)合免疫抗體，顯示出很強(qiáng)的蟲體抗原。正常小鼠血清處理的童蟲切片都沒看到特異熒光反應(yīng)。三倍體型童蟲，不論為何種免疫狀態(tài)所得，都存在比二倍體型童蟲更強(qiáng)的宿主抗原［11］。Westernblot實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，二倍體型和三倍體型蟲株的主要抗原22.5 k D蛋白白區(qū)帶以及27、28、29 k D 3條蛋白區(qū)帶均能分別與狗抗二倍體和三倍體蟲株感染血清發(fā)生反應(yīng)，兩型蟲株的22.5 k D蛋白區(qū)帶同樣能與大鼠和兔抗二倍體和三倍體蟲株血清發(fā)生反應(yīng)。但兩型蟲株的27、28、29 k D蛋白區(qū)帶卻不被大鼠和兔抗兩型蟲株血清聽識別。此外，二倍體蟲株的48.5 k D蛋白區(qū)帶只與免抗二倍體蟲株血清發(fā)生強(qiáng)反應(yīng)。未觀察到兩型蟲株與狗、大鼠和免的正常血清的反應(yīng)帶［12］。在兩型成蟲抗原與同源感染貓血清反應(yīng)中，有7條分子量在100.5～23 k D間的相同帶，而三倍體型成蟲抗原又多出2條（103、25 k D）特異帶。兩型童蟲抗原與同源感染鼠血清反應(yīng)后，均出現(xiàn)23.5、23 k D的二聯(lián)帶，二倍體型童蟲又多出一條24.5 k D特異帶?？偠灾?，兩型衛(wèi)氏并殖吸蟲的主要抗原組分基本相同，但也存在個別特異的抗原成分。兩型蟲株抗原均能誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生基本相似的免疫應(yīng)答。

5 DNA差異

不少學(xué)者認(rèn)為，異染色質(zhì)具有種的特異性，C帶的種屬特性也有助于從一個側(cè)面認(rèn)識物種和追溯親緣關(guān)系。二、三倍體型衛(wèi)氏并殖吸蟲染色體C帶多態(tài)性的同源染色體的多種組合，C帶的種屬特性分析有助于認(rèn)識兩型親緣關(guān)系。有學(xué)者認(rèn)為三倍體型是二倍體型所產(chǎn)生的同源三倍體［13］，但是趙吉濱等對衛(wèi)氏并殖吸蟲兩個型的染色體C帶帶型進(jìn)行了分析，結(jié)果表明兩型間存在差別。三倍體型衛(wèi)氏并殖吸蟲有兩套染色體，其中一套在C帶帶型上與二倍體型相一致，另一套染色體則具有不同的帶型，此差別突出表現(xiàn)在2、3、5、6和7號染色體上。由于這些染色體中結(jié)構(gòu)異染色質(zhì)分布的位置不同，表現(xiàn)為著色區(qū)段的位置、大小及深淺不一致。把兩型衛(wèi)氏并殖吸蟲成蟲成組地及單個地提取與純化其基因組DNA，用5種限制性內(nèi)切酶消化后，經(jīng)凝膠電泳，比較其酶解圖型，又用32P標(biāo)記兩型吸蟲的基因組DNA作探針，分別對經(jīng)7種酶消化的兩型DNA片段，進(jìn)行Southern印漬交叉雜交試驗(yàn)。顯示兩型BamHI、HinⅢ及EcoRI的酶切結(jié)果基本相同，但PstI、DdeI、HaeⅢ及HpaⅡ的結(jié)果卻顯示兩類型的DNA重復(fù)順序有明顯差別［21］。進(jìn)一步對不同地區(qū)兩型基因組DNA重復(fù)順序的比較分析發(fā)現(xiàn)，二倍體型成蟲DNA的Pst I消化物皆有6.6 k D片段，但未見個體差異。用雙酶切消化兩型成蟲DNA，經(jīng)分子雜交技術(shù)強(qiáng)化，用三倍體DNA為探針，使限制性酶切片段長度差異（RFLDs）更顯著，顯示兩型間具有意義的差別［13］。有報道在日本的并殖吸蟲二、三倍體中，Pst I、RsaI和HaeⅢ也具有不同的酶切片段。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果從基因水平顯示了兩型衛(wèi)氏并殖吸蟲型間的差別，說明兩型間存在一定程度的基因變異。因此有學(xué)者認(rèn)為二倍體型為衛(wèi)氏并殖吸蟲，三倍體型為前者在進(jìn)化過程中，通過染色體突變形成的獨(dú)立種。

6 寄生適宜性差異

據(jù)報道，衛(wèi)氏并殖吸蟲二、三倍體型病人痰中的蟲卵小于犬體內(nèi)蟲卵，即是同一類型衛(wèi)氏并殖吸蟲，不同宿主蟲卵的形態(tài)特征與大小不盡相同，由此得出無論二倍體型還是三倍體型因宿主的種類不同其寄生適宜性和致病性呈現(xiàn)很大的差異［14］。有人發(fā)現(xiàn)不同品系的衛(wèi)氏并殖吸蟲以及不同產(chǎn)地的二倍體型在大鼠體內(nèi)發(fā)育時存在差異的。二倍體型絕大部分可以童蟲形式長期滯留于肌肉中，少數(shù)可見于體腔，后者比前者發(fā)育好些，但大多數(shù)仍為不成熟童蟲?？梢姶笫蟛粌H可做該蟲的轉(zhuǎn)續(xù)宿主，也可起保蟲宿主作用［27］。在猴類中，恒河猴為兩型衛(wèi)氏并殖吸蟲的非適宜宿主，雖蟲體在恒河猴體內(nèi)未能發(fā)育達(dá)性成熟產(chǎn)卵，但可在宿主體內(nèi)長期存活。而短尾猴可為三倍體型的實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)續(xù)宿主［15］。調(diào)查和比較了不同地區(qū)人體肺吸蟲病的病原生物，發(fā)現(xiàn)兩型蟲體對終末宿主適應(yīng)有差別，導(dǎo)致患者在臨床和X線胸片特征以及痰中有無蟲卵排出等方面表現(xiàn)不同。三倍體型對人體寄主適應(yīng)，能發(fā)育成熟，故痰中有卵排出，臨床表現(xiàn)以肺部癥狀為主。二倍體型對人體寄主不適應(yīng)，未能發(fā)育成熟而停留在童蟲階段，故痰中無卵，臨床表現(xiàn)很象內(nèi)臟性蠕蟲幼蟲移行癥的癥狀及變態(tài)反應(yīng)。

7 展 望

由于吸蟲的差別明顯以及Miyazaki的權(quán)威性，二、三倍體定種似成定論。但是，僅僅經(jīng)過20年，澳大利亞學(xué)者布萊爾（Blair）等以分子生物學(xué)方法檢測來自臺灣、韓國和日本的衛(wèi)氏并殖吸蟲標(biāo)本，檢測蟲體線粒體細(xì)胞色素C氧化酶單位I（COI：mitochondrial cytochrome C oxidase subunit I）基因和核糖體DNA（r DNA），用于考察物種的變異與進(jìn)化，提出定種的不明確性［15］。核糖體DNA第二間隔區(qū)（ITS2：nuclear ribosomal DNA second internal transcribed spacer）序列具株的特異性，可作為病原體株的鑒定、診斷的靶基因和系統(tǒng)、進(jìn)化樹的繪制。

基因組DNA的限制性內(nèi)切酶圖譜分析，可利用蟲體DNA堿基序列不同，通過電泳顯示DNA條帶圖譜，在此基礎(chǔ)上，經(jīng)Southern印漬與DNA探針雜交，形成限制性片斷（RFLP）圖譜，反映出酶切位點(diǎn)間DNA長度的突變，因而測定種系發(fā)生關(guān)系。

自發(fā)現(xiàn)衛(wèi)氏并殖吸蟲存在二倍體型與三倍體型兩種類型以來，國內(nèi)外學(xué)者已就兩型的蟲體形態(tài)、蛋白和酶、染色體，以及它們對不同種類動物宿主的寄生適宜性和致病性進(jìn)行了廣泛研究和比較，試圖為兩型分類地位的確定和解釋該病的發(fā)病機(jī)理提供依據(jù)，但至今未有統(tǒng)一的定論。所以解決衛(wèi)氏并殖吸蟲懸而未決的定種問題，仍是緊迫的需要。

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