外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞的檢測(cè)在前列腺癌中的應(yīng)用

復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院泌尿外科,復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院腫瘤學(xué)系,上海 200032

外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞的檢測(cè)在前列腺癌中的應(yīng)用

瞿元元 綜述 戴波 審校

復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院泌尿外科,復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院腫瘤學(xué)系,上海 200032

前列腺癌是歐美國(guó)家最常見(jiàn)的男性泌尿生殖系統(tǒng)惡性腫瘤。近年來(lái)，我國(guó)前列腺癌的發(fā)病率明顯升高。腫瘤轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致多數(shù)前列腺癌患者治療失敗的重要原因，而腫瘤細(xì)胞進(jìn)入外周血循環(huán)系統(tǒng)是遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移的先決條件。外周血中循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cell，CTC)因能反映患者個(gè)體的腫瘤特征，且較易獲得而受到眾多學(xué)者的關(guān)注。本文就CTC的檢測(cè)方法以及CTC計(jì)數(shù)和分子標(biāo)志物在前列腺癌中的研究進(jìn)展作一綜述。

前列腺癌；循環(huán)腫瘤細(xì)胞；檢測(cè)；計(jì)數(shù)；分子標(biāo)志物

前列腺癌是歐美國(guó)家最常見(jiàn)的男性泌尿生殖系統(tǒng)惡性腫瘤，病死率僅次于肺癌居第二位［1］。近年來(lái)，由于社會(huì)人口老齡化、飲食結(jié)構(gòu)的改變及各種檢查技術(shù)的廣泛應(yīng)用，我國(guó)前列腺癌的檢出率明顯升高［2］。多數(shù)前列腺癌患者治療失敗的原因是在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中出現(xiàn)了遠(yuǎn)處器官的轉(zhuǎn)移。前列腺癌最常出現(xiàn)的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移部位是骨轉(zhuǎn)移，主要轉(zhuǎn)移途徑為經(jīng)血道轉(zhuǎn)移。

早在1869年，Ashworth［3］就報(bào)道在1例癌癥死亡患者的外周血中發(fā)現(xiàn)了類似腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞，并首次提出循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cell，CTC)的概念。CTC是指自發(fā)或因診療操作進(jìn)入外周血循環(huán)中的腫瘤細(xì)胞。進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)的腫瘤細(xì)胞絕大多數(shù)在短期內(nèi)死亡，只有極少數(shù)具有高度活力、高度轉(zhuǎn)移力的腫瘤細(xì)胞在循環(huán)系統(tǒng)中存活下來(lái)，相互聚集形成微小癌栓，并在一定條件下發(fā)展為轉(zhuǎn)移灶。因此，從外周血中檢測(cè)出CTC并不意味著患者一定有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，但是腫瘤細(xì)胞的脫落、侵襲并進(jìn)入血液循環(huán)是實(shí)現(xiàn)腫瘤轉(zhuǎn)移的重要一步，并為最終形成轉(zhuǎn)移病灶提供了可能。深入研究CTC有助于進(jìn)一步了解腫瘤的轉(zhuǎn)移機(jī)制、發(fā)現(xiàn)早期腫瘤患者的微轉(zhuǎn)移灶、為治療轉(zhuǎn)移性腫瘤提供科學(xué)依據(jù)。近年來(lái)，CTC檢測(cè)方法已取得突破性進(jìn)展，CTC計(jì)數(shù)及分子標(biāo)志物方面的研究也逐漸增多，本文針對(duì)CTC的檢測(cè)方法以及CTC計(jì)數(shù)和分子標(biāo)志物在前列腺癌中的研究進(jìn)展作一綜述。

1 CTC的檢測(cè)

由于CTC不能特異性區(qū)別于其他血細(xì)胞，且不同組織學(xué)類型和分子表型的腫瘤分別表達(dá)不同的標(biāo)志物，此外，外周血中CTC數(shù)量稀少，大約每105～107個(gè)單核細(xì)胞中才有1個(gè)CTC［4］，因此其精確分離非常困難。以往CTC的檢測(cè)通常包括細(xì)胞富集和細(xì)胞分析2個(gè)步驟。

富集技術(shù)通常是基于CTC的物理性質(zhì)(密度和大小)或免疫磁性將這些細(xì)胞特異性地富集起來(lái)，以提高CTC檢測(cè)的靈敏度。常用的細(xì)胞富集技術(shù)主要有過(guò)濾法、密度梯度離心法、免疫磁性細(xì)胞分選法等。過(guò)慮法和密度梯度離心法是根據(jù)細(xì)胞的物理性質(zhì)進(jìn)行的富集技術(shù)，缺乏特異度且靈敏度較低。免疫磁性細(xì)胞分選法是目前最常用的CTC富集方法，其基于特異性免疫識(shí)別原理，具有較高的特異性和富集效率，但該方法不能應(yīng)用于缺乏細(xì)胞表面標(biāo)志物的非上皮來(lái)源的實(shí)體瘤細(xì)胞(如肉瘤)。

分析技術(shù)主要依據(jù)腫瘤細(xì)胞本身的形態(tài)學(xué)特征或腫瘤細(xì)胞上表達(dá)的某些腫瘤特異性或器官特異性標(biāo)志物來(lái)發(fā)現(xiàn)CTC［5］。常用的細(xì)胞分析技術(shù)主要有免疫細(xì)胞化學(xué)(immunocytochemistry，ICC)技術(shù)、流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry，F(xiàn)CM)、熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH)及逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR)等。ICC和FCM的靈敏度相對(duì)較差。FISH技術(shù)以基因分子探針作為示蹤物，雖然提高了檢測(cè)的準(zhǔn)確性，但由于基因的差異性表達(dá)，分子探針并不能標(biāo)記所有的靶細(xì)胞，因此限制了此技術(shù)在外周血樣本中檢測(cè)CTC的應(yīng)用。RT-PCR技術(shù)是較有效的CTC檢測(cè)方法，其雖有較高的靈敏度［6］，但不能進(jìn)行CTC計(jì)數(shù)，因而無(wú)法實(shí)現(xiàn)CTC數(shù)目動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)；此外，檢測(cè)過(guò)程中上皮細(xì)胞的污染、假基因干擾等因素可能造成假陽(yáng)性結(jié)果。

近年來(lái)，隨著科技的日新月異和腫瘤分子生物學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步，美國(guó)Veridex公司開發(fā)了兼有CTC富集和分析功能的CellSearch檢測(cè)系統(tǒng),該技術(shù)檢測(cè)CTC的基本原理為: 上皮細(xì)胞黏附因子(epithelial cells adhesion molecule，EpCAM)抗體磁珠用于捕獲CTC、對(duì)細(xì)胞內(nèi)角蛋白具有特異性的抗-CK-藻紅蛋白(PE)用于識(shí)別上皮細(xì)胞、對(duì)白細(xì)胞具有特異性的抗-CD45-別藻藍(lán)蛋白(APC)用于識(shí)別白細(xì)胞、DAPI熒光核染料用于細(xì)胞核染色。最終符合腫瘤細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征且表現(xiàn)出EpCAM+、CK-PE+、DAPI+和CD45-APC-表型的細(xì)胞被定義為CTC［7］。該系統(tǒng)完成一次檢測(cè)僅需要7.5 mL外周血標(biāo)本，檢測(cè)結(jié)果以CTC數(shù)目/7.5 mL血樣的形式報(bào)告。利用CellSearch檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行CTC檢測(cè)具有以下優(yōu)勢(shì)：①CTC來(lái)源于患者體內(nèi)的腫瘤病灶，能夠反映患者個(gè)體的腫瘤特征；②CTC較易獲得，僅需要7.5 mL的外周血標(biāo)本；③如果能夠從患者外周血中分離出足夠的CTC用于相關(guān)腫瘤分子標(biāo)志物研究，其可以取代針對(duì)腫瘤原發(fā)灶或轉(zhuǎn)移病灶進(jìn)行的創(chuàng)傷巨大的活檢術(shù)。由于該技術(shù)創(chuàng)傷小，利于臨床醫(yī)生多次獲取標(biāo)本。目前，CellSearch檢測(cè)系統(tǒng)已被美國(guó)食品和藥物監(jiān)督管理局(Food and Drug Administration，F(xiàn)DA)批準(zhǔn)用于多種惡性腫瘤外周血中CTC的計(jì)數(shù)研究。

2 CTC計(jì)數(shù)

應(yīng)用CellSearch檢測(cè)系統(tǒng)可以進(jìn)行CTC計(jì)數(shù)，觀察治療前患者外周血中基線CTC計(jì)數(shù)以及治療過(guò)程中CTC數(shù)目的變化，有助于評(píng)估預(yù)后、評(píng)價(jià)治療效果及指導(dǎo)個(gè)體化治療。由于幾項(xiàng)大規(guī)模臨床試驗(yàn)結(jié)果均顯示，基線CTC計(jì)數(shù)及治療過(guò)程中CTC數(shù)目的變化為轉(zhuǎn)移性乳腺癌、結(jié)直腸癌及前列腺癌患者無(wú)進(jìn)展生存期(progression-free survival，PFS)和(或)總生存期(overall survival，OS)的獨(dú)立預(yù)后因素，故CTC計(jì)數(shù)已被FDA批準(zhǔn)用于預(yù)測(cè)轉(zhuǎn)移性乳腺癌、結(jié)直腸癌及前列腺癌的PFS和OS［8-10］。

在IMMC38臨床試驗(yàn)中，De Bono等［10］應(yīng)用CellSearch檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)入組的231例去勢(shì)抵抗性前列腺癌(castration-resistant prostate cancer，CRPC)患者進(jìn)行CTC計(jì)數(shù)并分析基線CTC計(jì)數(shù)及化療過(guò)程中CTC數(shù)目的變化與患者OS的關(guān)系。研究發(fā)現(xiàn)，基線CTC計(jì)數(shù)≥5的患者中位OS(11.5個(gè)月)顯著短于基線CTC計(jì)數(shù)＜5的患者(21.7個(gè)月)，前組患者的死亡風(fēng)險(xiǎn)較后組患者高2.3倍(HR=3.3，P＜0.000 1)；化療后2～5周，6～8周，9～12周及13～20周CTC計(jì)數(shù)仍≥5的患者預(yù)后較CTC計(jì)數(shù)＜5的患者差(兩組患者中位OS分別為6.7～9.5個(gè)月及19.6～20.7個(gè)月，HR：3.6～6.5，P＜0.000 1)。De Bono等［10］還根據(jù)治療前后CTC計(jì)數(shù)的變化將患者分為4組，第1組：治療前后CTC計(jì)數(shù)均＜5(中位OS＞26個(gè)月)，第2組：治療前CTC計(jì)數(shù)≥5而治療后下降至＜5(中位OS為21.3個(gè)月)，第3組：治療前CTC計(jì)數(shù)＜5而治療后升高至≥5(中位OS為9.3個(gè)月)，第4組：治療前后CTC計(jì)數(shù)均≥5(中位OS為6.8個(gè)月)，統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果證實(shí)第4組患者的預(yù)后顯著差于第1組和第2組患者(P＜0.000 1)。此外，該研究還發(fā)現(xiàn)與治療后PSA變化相比，CTC計(jì)數(shù)的變化更能預(yù)測(cè)患者的死亡風(fēng)險(xiǎn)。正是基于此項(xiàng)臨床研究的結(jié)果，2008年2月，美國(guó)FDA批準(zhǔn)CTC計(jì)數(shù)可用于晚期前列腺癌患者以協(xié)助判斷患者的預(yù)后。Olmos等［11］對(duì)119例CRPC患者進(jìn)行類似的研究，亦發(fā)現(xiàn)基線CTC計(jì)數(shù)和治療后CTC數(shù)目的變化均為OS的獨(dú)立預(yù)后因素，治療使CTC計(jì)數(shù)降低至＜5的患者從治療中獲益較大。這些研究都充分證實(shí)了CTC數(shù)目的動(dòng)態(tài)變化可用于檢測(cè)患者對(duì)治療的反應(yīng)，對(duì)于治療一段時(shí)間后CTC計(jì)數(shù)仍未下降的患者，可考慮更換其他治療方案以提高治療效果，同時(shí)又可以避免醫(yī)療資源的浪費(fèi)。

CTC計(jì)數(shù)與激素敏感性前列腺癌患者內(nèi)分泌治療的療效亦有相關(guān)性。Okegawa等［12］對(duì)80例轉(zhuǎn)移性前列腺癌患者內(nèi)分泌治療前進(jìn)行基線CTC計(jì)數(shù)，其中44例CTC計(jì)數(shù)≥5的患者內(nèi)分泌治療中位有效期為17個(gè)月，而CTC計(jì)數(shù)＜5的患者，內(nèi)分泌治療中位有效期≥32個(gè)月，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.007)，表明CTC計(jì)數(shù)是內(nèi)分泌治療的敏感預(yù)測(cè)因子。Goodman等［13］的研究也顯示，CTC計(jì)數(shù)是轉(zhuǎn)移性激素敏感性前列腺癌(metastatic hormone-sensitive prostate cancer，mHSPC)的重要預(yù)后因素。他們對(duì)33例mHRPC患者內(nèi)分泌治療前及內(nèi)分泌治療2個(gè)月后進(jìn)行CTC計(jì)數(shù)及血生化指標(biāo)的檢測(cè)，統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果顯示，盡管單因素分析中基線CTC計(jì)數(shù)、堿性磷酸酶濃度、乳酸脫氫酶濃度、睪酮水平及治療過(guò)程中CTC數(shù)目的變化與mHRPC患者進(jìn)展至CRPC有關(guān)，但在多因素分析中僅基線CTC計(jì)數(shù)為mHRPC患者進(jìn)展至CRPC的獨(dú)立預(yù)后因素。該研究結(jié)果提示，基線CTC計(jì)數(shù)可用于預(yù)測(cè)mHRPC患者對(duì)內(nèi)分泌治療的敏感時(shí)間，基線CTC計(jì)數(shù)較高的患者可能較快進(jìn)展至CRPC階段。

在CTC計(jì)數(shù)與患者預(yù)后關(guān)系的研究中，多數(shù)是以5作為CTC計(jì)數(shù)的臨界值［14-17］。Goodman等［18］對(duì)100例CRCP患者進(jìn)行CTC計(jì)數(shù)，并研究其對(duì)OS的預(yù)后作用及與其他生化指標(biāo)的相關(guān)性。閾值分析結(jié)果顯示，當(dāng)以4為CTC計(jì)數(shù)的臨界值時(shí)，CTC計(jì)數(shù)與OS及影像學(xué)檢測(cè)到轉(zhuǎn)移性病灶均有良好的相關(guān)性。多因素分析結(jié)果顯示，基線CTC計(jì)數(shù)為CRPC患者獨(dú)立的預(yù)后因素(P=0.001)。

大量研究已經(jīng)證實(shí)CTC計(jì)數(shù)為前列腺癌患者的敏感預(yù)后因子。但是，在CTC的臨床應(yīng)用中仍存在一些問(wèn)題，例如對(duì)于CTC預(yù)測(cè)預(yù)后的最佳臨界值仍有爭(zhēng)議，CTC在低腫瘤負(fù)擔(dān)的晚期前列腺癌患者中的預(yù)測(cè)價(jià)值有待進(jìn)一步評(píng)估［18］。因此，仍需要開展大規(guī)模的Ⅲ期臨床試驗(yàn)來(lái)解決這些問(wèn)題，并進(jìn)一步完善CTC計(jì)數(shù)在前列腺癌中的應(yīng)用。

3 CTC分子標(biāo)志物檢測(cè)

由于在前列腺癌疾病進(jìn)展過(guò)程中，促進(jìn)腫瘤發(fā)展的分子標(biāo)志物可能會(huì)發(fā)生變化。為了實(shí)現(xiàn)有效的個(gè)體化治療，根據(jù)腫瘤所表達(dá)分子特征選擇治療方案至關(guān)重要。然而，這常因臨床工作中難以獲得腫瘤標(biāo)本而受到限制。CTC來(lái)源于腫瘤原發(fā)灶或轉(zhuǎn)移病灶，能夠反映患者腫瘤的分子特征［19-20］。因此，CTC分子標(biāo)志物的檢測(cè)可用于研究個(gè)體腫瘤的遺傳背景，發(fā)現(xiàn)能夠預(yù)測(cè)腫瘤對(duì)治療敏感性的分子決定因素，為靶向治療以及腫瘤耐藥機(jī)制的研究提供理論依據(jù)。近年來(lái)，CTC分子標(biāo)志物方面的研究受到眾多學(xué)者的關(guān)注，在前列腺癌領(lǐng)域研究較多的有雄激素受體(androgen receptor，AR)基因的擴(kuò)增和突變、PTEN的缺失、TMPRSS2-ETS基因融合及表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)的表達(dá)等［21-25］。

研究顯示，AR信號(hào)通路的異常激活在CPPC的發(fā)生、發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用［26-27］。AR屬于細(xì)胞內(nèi)受體超家族成員，能通過(guò)配體活化的轉(zhuǎn)錄因子來(lái)發(fā)揮生物學(xué)作用，AR自細(xì)胞質(zhì)向細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移會(huì)導(dǎo)致AR信號(hào)通路的激活，從而促進(jìn)CRPC的發(fā)展［28］。Darshan等［21］在CRPC患者接受多西他賽化療期間利用CellSearch檢測(cè)系統(tǒng)分離其外周血中CTC，采用免疫熒光技術(shù)標(biāo)記AR后在共聚焦顯微鏡下對(duì)AR進(jìn)行亞細(xì)胞水平的定位。他們發(fā)現(xiàn)CRPC患者對(duì)多西他賽化療的反應(yīng)與AR的亞細(xì)胞水平定位有關(guān)，對(duì)化療耐藥的患者，CTC細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核中均有AR分布，而對(duì)化療有效的患者CTC中AR僅分布于細(xì)胞質(zhì)中，且細(xì)胞內(nèi)的微管處于聚集狀態(tài)。該研究結(jié)果提示，多西他賽可能部分通過(guò)抑制AR自細(xì)胞質(zhì)向細(xì)胞核的轉(zhuǎn)移而發(fā)揮抗腫瘤作用。

因此，檢測(cè)CRPC患者外周血CTC中AR的亞細(xì)胞水平定位可以預(yù)測(cè)患者對(duì)多西他賽化療的反應(yīng)，CTC細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核中均有AR分布的患者可能對(duì)多西他賽化療反應(yīng)較差，應(yīng)更換其他治療方案。

腫瘤基因組學(xué)的變革極大地改變了腫瘤的診斷及治療模式，并引導(dǎo)我們進(jìn)入依據(jù)患者腫瘤的分子特征選擇治療方案的個(gè)體化治療時(shí)代。然而，要想在臨床實(shí)踐中實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)，還需要在大規(guī)模的前瞻性臨床試驗(yàn)中進(jìn)一步驗(yàn)證這些標(biāo)志物對(duì)治療的預(yù)測(cè)作用。

4 展望

目前，CTC的檢測(cè)已取得了突破性的進(jìn)展，但是各種檢測(cè)方法仍無(wú)統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，仍需在未來(lái)的研究中建立標(biāo)準(zhǔn)化的檢測(cè)方法，以提高CTC檢測(cè)的靈敏度及特異度。CTC計(jì)數(shù)對(duì)前列腺癌患者預(yù)后的預(yù)測(cè)作用已得到了初步證實(shí)，在治療前進(jìn)行基線CTC計(jì)數(shù)及治療過(guò)程中檢測(cè)CTC數(shù)目的變化，有助于評(píng)價(jià)抗腫瘤藥物對(duì)前列腺癌的治療效果以及評(píng)估患者預(yù)后。另外，分析研究CTC的分子生物學(xué)特征，將有助于指導(dǎo)前列腺癌患者的個(gè)體化治療，尋找新的治療靶點(diǎn)，為新型抗前列腺癌藥物的開發(fā)提供理論依據(jù)，最終造福患者。

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Detection and clinical application of circulating tumor cells in peripheral blood of patients with prostate cancer

QU Yuan-yuan, DAI Bo (Department of Urology, Fudan University Shanghai Cancer Center, and Department of Oncology, Shanghai Medical College, Fudan University, Shanghai 200032, China)

DAI Bo E-mail: bodai1978@yahoo.com.cn

Prostate cancer is the most common urogenital malignant tumor among males in Western countries. Recently, more and more prostate cancer patients were diagnosed in China. Tumor metastasis is one of the main cause for the failure of prostate cancer treatment. Tumor cells entering into circulation system is the prerequisite for tumor metastasis in the distant organs. Many studies began to focus on circulating tumor cells in peripheral blood (CTC) because it could represent individual tumor characteristics. This review focused on the detection, enumeration and biomarkers of CTC.

Prostate cancer; CTC; Detection; Enumeration; Biomarker

R737.25

：A

：1007-3639(2013)01-0064-05

2012-08-27

2012-11-20）

聲 明

《中國(guó)癌癥雜志》2012年第22卷第8期第68-71頁(yè)刊登的文章“121例非小細(xì)胞肺癌患者新輔助化療前后腫瘤標(biāo)志物及免疫指標(biāo)的研究”，受廣西自然科學(xué)基金項(xiàng)目資助(No：2011GXNSFA018248)，情況屬實(shí)，特此聲明。

上海市科委醫(yī)學(xué)引導(dǎo)項(xiàng)目(No：124119a7300)；上海市科委“創(chuàng)新行動(dòng)計(jì)劃”國(guó)際學(xué)術(shù)合作交流項(xiàng)目(No：12410709300)；復(fù)旦大學(xué)“985工程”三期腫瘤研究項(xiàng)目Ⅱ(No：985Ⅲ-YFX0102)。

戴波 E-mail:bodai1978@yahoo.com.cn

DOI: 10.3969/j.issn.1007-3969.2013.01.012